甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测甲型H1N1流感病毒[Influenza A(H1N1)pdm09]的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因保守序列,设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,采用实时荧光定量PCR技术检测甲型H1N1流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-HA标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,敏感性可达50 TCID50。本研究中,甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法与经典H1N1、类禽H1N1、类人H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒无交叉反应。结果表明,该方法可以在人类和动物间有效地检测甲型H1N1流感病毒。     

多重RT-PCR方法检测新型甲型H_1N_1流感病毒的研究

为了建立快速检测新型甲型H1N1流感病毒的多重PCR技术,根据GenBank中公布甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)的HA和NA基因序列,设计并合成两套特异性引物。使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒和自行设计合成的引物建立多重RT-PCR反应,按照预期的PCR产物序列合成的DNA作为阳性对照。结果表明,该方法具有良好的特异性,可以将甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)与传统甲型H1N1、H3N2、H5N1、H6N2和H9N2亚型流感病毒区分。该方法同时具有较高的灵敏度,最低可以检测到100个拷贝的阳性克隆质粒。在对183份发热病人临床咽拭子样品检测中发现了10份阳性样品,对350份猪鼻腔拭子样品检测全部呈阴性,结果与中国检验检疫科学研究院试剂盒检测结果一致,说明了该多重RT-PCR方法在临床检测新型甲型H1N1流感病毒方面具有广阔的应用前景。     

甲型H1N1与季节性H1N1流感病毒检测基因芯片的制备与初步应用

建立DNA微列阵技术检测甲型H1N1和季节性H1N1流感病毒的方法,进而探讨该方法用于检测临床标本的可行性。通过生物医学数据库甲型H1N1流感病毒及季节性H1N1亚型流感HA与NA基因进行检索和筛选,应用分子生物学软件,进行序列分析、引物及探针设计,并进行验证。试验所设计的探针可以对甲型H1N1流感与季节性H1N1流感病毒进行区分,用该方法检测了长春市CDC送检的6份疑似甲型H1N1流感病毒临床病例,4份阳性,检测结果同实时荧光定量PCR方法一致。结果表明,利用本研究建立的DNA微列阵技术检测甲型H1N1流感病毒方法,特异性和敏感性强,可作为甲型H1N1流感病毒临床标本检测方法。     

甲型H1N1流感病毒核酸检测能力验证样品制备及其应用效果评价

为考核实验室检测甲型H1N1流感病毒的能力,设计和实施了“CNAS T0459甲型H1N1流感病毒核酸检测能力验证计划”.利用甲型H1N1流感病毒(2009)和经典H1N1猪流感病毒核酸标准物质制备6组能力验证阳性样品,经实验室检测分析,所制备的样品均匀性和稳定性均达到中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求.将6组阳性样品和1组阴性样品编号后下发54家参试实验室,共有50家实验室报送了有效数据,其中完全达到能力验证要求的实验室共34家,满意率达68％,其余16家为不满意实验室,包括8家实验室检测经典H1N1猪流感病毒满意,但甲型H1N1流感病毒(2009)特异性检测不满意.本次能力验证为整体提升我国甲型H1N1流感病毒的检测水平和评估各级实验室检测能力具有重要意义.     

H1N1猪流感病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的:建立H1N1猪流感病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法:从GenBank中获得H1N1猪流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)基因序列,应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列,利用Primer ExplorerV4软件在序列保守区域设计LAMP引物,即外引物和内引物,同时以H1N1猪流感病毒的cDNA作为阳性模板,对试验中的几个反应条件进行优化。结果:LAMP检测方法对H1N1猪流感病毒的灵敏度达到4～6个拷贝,其引物对于H9亚型禽流感病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒均无非特异性扩增,表现出良好的特异性。结论:建立的H1N1猪流感病毒环介导等温扩增快速检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,为快速检测猪流感病毒提供了新方法和新思路。     

H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测H7N9亚型流感病毒的通用荧光RT-PCR方法,根据GenBank数据库中收录的相关基因组序列,应用Primer 5.0软件设计合成针对H7和N9序列的特异性引物和Taq Man探针,并对该方法开展特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:H7和N9核酸片段最低检测限均为1.7×10~3 copies/mL;使用该方法重复检测10次,H7和N9核酸片段检测的变异系数(CV)1%,说明稳定性良好;利用第二代人感染H7N9流感病毒核酸检测试剂国家参考品样品,测得该方法灵敏度为100%(10/10)、特异度为100%(20/20)。结果表明,本研究建立的H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR方法快速、准确、稳定性高、特异性好,为控制流感病毒传播增添了技术手段。     

H5N6亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10~(-5),NA基因检测的灵敏度为10~(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。     

焦磷酸测序技术在确证猪甲型H1N1流感病毒中的应用

目的本研究旨在通过对猪甲型H1N1流感病毒进行序列信息分析的基础上,利用焦磷酸测序技术建立一种快速、简单地确证猪甲型H1N1流感病毒的方法。方法通过序列信息比对,设计H1HA和N1NA基因保守区段的扩增引物及测序引物。从感染猪甲型H1N1病毒的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(PSQ)针对HA基因和NA基因进行保守核苷酸区段的测序分析。利用扩增引物与其他猪源病毒进行特异性试验,利用测序引物进行重复性试验。将该方法与病毒分离和荧光定量RT-PCR方法做临床样品的平行检测,并比较结果。结果通过序列信息比对寻找到表征H1N1亚型的核苷酸保守区段,经焦磷酸测序后能进一步确证毒株的序列信息为猪甲型H1N1流感病毒。特异性试验表明,不与其他猪源病毒发生交叉反应;重复性试验表明,重现性为100%。对221份临床样品检测表明,病毒分离鉴定与焦磷酸测序方法结果符合率为96.8%,与TaqMan荧光定量方法检测结果符合率90.3%。经统计学分析,焦磷酸测序确证与病毒分离鉴定在检测临床样品上,两者差异不显著。结论基于序列分析的焦磷酸测序技术可以作为进一步确证方法使用。     

抗猪甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体.采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293T细胞中得到表达.将pCAGGS-HA以100 μg·只-1剂量免疫5周龄BALB/c小鼠,获得4株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为11G7、3C10、3G3和2B11.其中11G7诱导小鼠产生的腹水HI效价为14log2,中和效价为1:8 192,HI试验结果进一步表明11G7只与甲型H1N1流感病毒发生反应,而不与其他H1N1、H1N2、H3N2、H5N1及H9N2亚型流感病毒反应.该MAb的制备将为建立猪甲型H1N1流感病毒与传统亚型SIV的鉴别诊断方法奠定基础.     

H5N8亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

流感病毒变异迅速,为研究和建立一种针对H5 N8亚型流感病毒核酸准确灵敏的检测方法,分别选择H5 N8亚型流感毒株序列相对保守的HA基因和NA基因作为H5 N8亚型流感病毒检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,选择两种不同的荧光标记,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5 N8亚型禽流感病毒检测方法。实验结果表明,所建立的H5 N8亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10-5,NA基因检测的灵敏度为10-5,重复性好,特异性佳。结果表明:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5 N8亚型流感病毒,耗时短,可很快作出判定结果,适用于H5 N8流感病毒的分子生物学检测和监测。对于控制流感流行,减少经济损失,最大限度保护社会人群健康具有很大意义。     

山羊瘤胃中单宁降解菌的分离、筛选和鉴定

本试验旨在从山羊瘤胃中分离、筛选和鉴定单宁降解菌。从隆林山羊瘤胃采集内容物,采用单宁浓度耐受培养基进行初筛,再采用单宁酶活力鉴定培养基分离、筛选单宁降解菌,筛选出的细菌通过16S r DNA基因序列测定初步鉴定,将菌株在单宁浓度为0.5%、1%、1.5%的单宁酶诱导培养基中培养,测定酶活力。结果表明:共分离、筛选到4株降解单宁的细菌,根据16S r DNA基因序列分析结果,分别为产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、克斯特菌(Kerstersia)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。经单宁酶诱导培养基培养后,Kerstersia的胞内单宁酶活力高于其他3株菌,而其他3株菌的酶活力较为接近;Kerstersia、Providencia vermicola和Pseudomonas aeruginosa经1%单宁浓度诱导的单宁酶活力均高于经0.5%和1.5%单宁浓度诱导(P0.05)。本试验成功从山羊瘤胃中筛选、分离、鉴定出4株单宁降解菌,且它们均表现出较高的单宁酶活力。     

中国草地自然灾害及其防治对策

介绍了中国草地的五大自然灾害,提出了综合防治的五项对策。     

An equine herpesvirus 1 (EHV-1) vectored H1 vaccine protects against challenge with swine-origin influenza virus H1N1

In 2009, a novel swine-origin H1N1 influenza A virus (S-OIV), antigenically and genetically divergent from seasonal H1N1, caused a flu pandemic in humans. Development of an effective vaccine to limit transmission of S-OIV in animal reservoir hosts and from reservoir hosts to humans and animals is necessary. In the present study, we constructed and evaluated a vectored vaccine expressing the H1 hemagglutinin of a recent S-OIV isolate using equine herpesvirus 1 (EHV-1) as the delivery vehicle. Expression of the recombinant protein was demonstrated by immunofluorescence and western blotting and the in vitro growth properties of the modified live vector were found to be comparable to those of the parental virus. The EHV-1-H1 vaccine induced an influenza virus-specific antibody response when inoculated into mice by both the intranasal and subcutaneous routes. Upon challenge infection, protection of vaccinated mice could be demonstrated by reduction of clinical signs and faster virus clearance. Our study shows that an EHV-1-based influenza H1N1 vaccine may be a promising alternative for protection against S-OIV infection.     

A/H1N1研究进展

2009年3以来,包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了甲型H1N1流感[Swine-origin Influenza A (A/H1N1)]疫情,WHO已于2009年6月20日将此次流感流行的预警级别提升至6级.现已基本明确,引起此次流感疫情的A/H1N1流感病毒是猪流感病毒(Swine Influenza Virus, SIV)的一种新型变异株.此次流感疫情的发生,再次使猪流感成为社会各界关注的焦点之一.本文就甲型H1N1流感的临床表现、病毒特征、相互关系及其对动物卫生监督工作的影响等作一综述.     

鸽禽I型副粘病毒油佐剂灭活苗对肉种鸽免疫效果观察

用鸽Ａ／ＰＭＶ－１ＳＸ株（简称ＳＸ株）制成的油佐剂灭活苗与ＮＤＶ油佐剂灭活苗分别免疫肉种鸽,免疫后２０天抗体水平达到峰值,抗体水平在３ｌｏｇ２以上维持３０天以上。免疫后４０天用鸽ＳＸ株和新城疫强毒对两种疫苗免疫鸽分别进行攻击,两种疫苗免疫组对ＮＤＶ强毒攻击的保护率均为１００％,鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗免疫组对鸽ＳＸ株攻击的保护率为１００％,而ＮＤＶ油佐剂灭活苗免疫组对鸽ＳＸ株攻击的保护率仅为６６７％。鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗田间试验抽检４８份肉种鸽血清,抗体平均值为４３０±１１６ｌｏｇ２。