绵羊胚胎细胞核移植的研究

采用国产药品和试剂对绵羊进行超数排卵和胚胎细胞核移植。以 McGrath Solter 和Willadsen 两种去(注)核方法,将8-细胞胚胎细胞核经电融合植入去核成熟卵母细胞内,并经琼脂包埋和中间受体培养,使移核胚胎发育。实验结果表明:(1)用国产激素和化学药品进行绵羊胚胎细胞核移植可使移核胚胎在中间受体内发育为囊胚或桑椹胚;(2)去核时卵母细胞质剩得过少可导致移核胚过早(6-细胞期)发生致密化或形成内细胞团细胞数目较少的小囊胚;(3)Willadsen 去(注)核方法的去核和注核操作成功率明显优于 McGrath-Solter 方法;应用McGrath Solter 法的去核率仅为60%;(4)强度为0.63KV/cm,持续160微秒(μs)的一次电脉冲获得的胚胎融合率最高,达71.2%;以同样电场条件刺激未去核卵母细胞的孤雌活化率在71.4%。     

家兔胚胎细胞核移植的研究

 以兔8-16细胞的新鲜胚胎或冷冻-解冻胚胎的卵裂球作为细胞核供体，成熟的去核卵母细胞作为细胞核受体。经显微操作，将分离的单个卵裂球移入去核卵母细胞透明带内，制成322枚组合卵。对组合卵施加一个1200伏/cm（V/cm）和80微秒（μs）的直流电脉冲，使卵裂球的细胞核导入去核卵母细胞之中。由新鲜供体胚胎或冷冻-解冻供体胚胎与去核卵母细胞构成的组合卵的融合率分别为87.2%(251/288)和73.5%(25/34)。将部分已融合的细胞核移植(Nuclear Transplantation，NT)卵置于含10%胎犊血清(FCS)的TCM199培养液中，在充以5%CO#-2+空气的培养箱内，于39℃下培养20小时，新鲜供体胚胎和冷冻-解冻供体胚胎的NT卵发育至2-4细胞的分裂率分别为58.0%(47/81)和53.8%(7/13)。将53枚NT卵移入同步发情的5只受体母兔的输卵管内，结果一只母兔于妊娠第33天经剖腹手术产出1只体重为70克雌性核移植仔兔。实验结果表明，兔8-16细胞阶段的新鲜胚胎和冷冻-解冻胚胎均可在细胞核移植中用作细胞核供体。     

末期去核在牛体细胞核移植中的应用

受体卵母细胞的去核对核移植的效率起决定性作用。很多去核方法已经应用到体细胞核移植当中,并且成功地产生了核移植胚胎。通常我们使用第二次减数分裂中期(MⅡ期)的卵母细胞作为受体细胞进行去核,但是去核效率很低。虽然使用荧光染料和紫外线的照射来完成去核程序可以提高去核效率,但是这些措施有损害细胞质的危险。所以,一种避免使用DNA染料和紫外线照射又能提高去核效率的末期去核方法被发展起来了。本文详述了牛卵母细胞末期去核方法在体细胞核移植中的应用,为从事哺乳动物克隆研究的学者提供参考。     

提高山羊卵丘细胞核移植效果的研究

 【目的】提高山羊卵丘细胞核移植效果。【方法】采用秋水仙胺提高山羊卵母细胞去核率,5-氮-2'-脱氧核苷（5-aza-dC）和曲古菌素A（TSA）影响山羊卵丘细胞核移植胚胎。【结果】0.5 μg?ml-1秋水仙胺处理山羊卵母细胞效果最好,胞质突起率达91.7%（P＜0.05）;通过比较盲吸去核法与化学辅助去核法的去核率及构建卵丘细胞核移植胚胎的体外发育能力发现,化学辅助去核法的去核率达100%,所构建的重构胚体外发育能力较高,桑椹胚率和囊胚率分别达25.2%和13.1%,显著高于盲吸去核法（P＜0.05）。采用0.01 μmol?L-1的5-aza-dC处 理山羊卵丘细胞,核移植胚胎桑椹胚率和囊胚率分别达30.4%和17.0%,显著高于其它各组（P＜0.05）;采用 400 nmol?L-1TSA处理山羊卵丘细胞,核移植胚胎桑椹胚率、囊胚率分别达31.5%和15.2%。【结论】化学辅助去核法的去核率显著高于盲吸去核法,采用0.01 μmol?L-1的5-aza-dC或400 nmol?L-1 TSA处理山羊卵丘细胞,效果最佳。     

山羊卵核移植的研究

 选用陕北黑山羊的4-32细胞胚和萨能奶山羊的次级卵母细胞分别作核供体和胞质供体。在显微操作仪的控制下，将分离后的单个卵裂球注入去核次级卵母细胞的卵周隙。采用电融合法诱导卵裂球和去核次级卵母细胞融合。通过体外培养和移植，检查卵核移植的效果。本研究证明：⑴在4-32细胞期，核供体胚的发育阶段对山羊卵核移植胚的体外发育无显著影响；⑵由山羊4-32细胞期胚胎的卵裂球和去核次级卵母细胞构成的卵核移植胚在体内仍可发育为正常个体；⑶用注射LH后25-35小时的次级卵母细胞作胞质供体均可获得较高的卵核移植胚体外发育率；⑷用900伏/厘米的电场强度进行2个80微秒的电脉冲处理，诱导卵裂球和去核次级卵母细胞融合，可获得更好的电融合效果。根据山羊胚胎性RNA在2细胞期出现的事实和本研究的上述结果，作者认为，次级卵母细胞的胞质对移入的晚期卵裂胚细胞核可能有去分化作用。     

广西巴马小型猪体细胞核移植体系的建立

通过建立广西巴马小型猪体细胞核移植培养体系,为后续转基因克隆猪生产及其相关研究提供最佳条件.试验探讨了盲吸法对猪卵母细胞的去核效率;利用分离到的广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,探讨6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)和细胞松弛素B(CB)对其后续胚胎发育的影响;利用分离到的广西巴马小型猪腹部成纤维作供体,探讨其对核移植胚胎的发育效率.结果表明:猪卵母细胞盲吸法去核的效率为73.75％;广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,6-DMAP和CB对其后续胚胎发育没有显著差异(分裂率和囊胚率分别为:89.89％and 6.74％vs.82.95％and 5.68％,P＞0.05);腹部成纤维细胞作供体,重构胚胎的融合率、分裂率和囊胚率分别为55.40％、67.53％和6.49％.采用盲吸法可以对体外成熟猪卵母细胞成功去核,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞和附睾成纤维细胞均可作供体成功构建体细胞核移植胚胎,并可以发育到囊胚.     

生物克隆繁殖的基因逐步缺失探讨

英国山羊"多莉"及中国山羊"元元"是将体细胞的细胞核植入去核卵细胞内再移植到母体子宫内繁殖出来的新的山羊个体,俗称"无性繁殖",或者说是个体复制或"克隆"(clone).当然,这种复制无需"授精"这一步骤,但也不是百分之百由体细胞发育成新个体,至少需要卵子,虽然卵细胞作出了去除细胞核的处理,但仍然保留了细胞除细胞核以外的物质,如细胞质及其质体.其实,细胞质具有遗传特性已是不争的事实,新的个体的许多特性是由细胞质的遗传物质所控制,这就是所谓的母性遗传或称细胞质遗传.尽管如此,这些轰动一时的克隆新的个体,仍然存在着一些缺陷.据报道,"多莉"产生了不合情理的老化进程,以及体内器官较大等缺陷.因此,不得不使人们对这种克隆新个体产生疑问:为什么会有这样的情况?这样就会使我们联想到其它的无性繁殖或有性繁殖产生的一些现象.     

动物胚胎干细胞在动物科学中的应用

自Evans等从延迟着床胚胎中分离出小鼠胚胎干细胞(ES)以来,科学家就不断地对胚胎干细胞进行深入研究,特别是在应用研究方面,将转基因技术、克隆技术、器官移植以及胚胎工程等方面结合起来在动物遗传育种、胚胎学的领域应用。就此而言,胚胎干细胞在生产转基因动物、克隆动物、细胞分化研究、生产用于人类器官移植的动物器官以及细胞分化的机制研究。本文就以上指出的这些方面的应用前景进行评述和展望。生产转基因动物1.生产转基因动物的程序和方法利用ES细胞生产转基因动物的方法有:(1)细胞核移植法:以转基因ES细胞作供体进行细胞核移植,…     

山羊胚胎克隆的研究

应用细胞核移植技术，把未分化或处于不同发育阶段的胚胎分裂球或细胞移入成熟的去核卵母细胞，并使之融合，成为Ｇ０代克隆卵。将Ｇ０代克隆卵移入同期发情的山羊输卵管中培养５ｄ，回收得到克隆胚，选择其中正常发育至８～１６细胞的克隆胚，将其胚胎细胞再移入成熟的去核卵母细胞，并进行电融合，构成Ｇ１代再克隆卵，１２９枚Ｇ０代克隆卵和１４３枚Ｇ１代再克隆卵移入同期发情的山羊输卵管，获得Ｇ０代克隆羊２只和Ｇ１代再克隆     

兔胚胎干细胞核移植克隆技术

对兔胚胎干细胞核移植过程中受体卵子的去核方法、供核兔胚胎干细胞的预处理及电融合的场强等操作技术进行了比较试验.结果表明,压迫式去核方法的去核有效率达85.71%,略高于注吸式.当电融合场强为1.6或1.8 kV/cm时,重组胚的卵裂率和桑、囊胚率较高,分别达到33.3%和16.67%.在操作液中添加PVA对獭兔干细胞核转入融合与后期囊胚发育均有不同程度的影响,使囊胚发育率显著提高.将11个融合胚及5枚发育囊胚移植到受体兔体内,未发现妊娠现象.     

陕北白绒山羊种公羊的体细胞克隆

【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6甲基氨基嘌呤（6-DMAP）对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCRRFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融合率为71.54%(181/253),体外培养后的卵裂率为68.33%（123/180）,囊胚发育率为25.20%（31/123）;在此基础上,构建了537枚克隆胚,将其中卵裂的359枚分别移植到32只代孕母羊体内,移植60 d后,有2只受体母羊确认妊娠,最终1只受体母羊妊娠第4月流产出2只死羔;另1只受体母羊维持到期并顺产体细胞克隆羊1只。经遗传学鉴定,2只流产羊羔与1只存活个体均为体细胞核移植后代。【结论】获得陕北白绒山羊克隆个体,建立了相对完善的陕北白绒山羊克隆技术体系。     

山羊胚胎克隆的研究

应用细胞核移植技术，把未分化或处于不同发育阶段的胚胎分裂球或细胞移入成熟的去核卵母细胞，并使之融合，成为Ｇ＿０代克隆卵。将Ｇ＿０代克隆卵移入同期发情的山羊输卵管中培养５ｄ，回收得到克隆胚，选择其中正常发育至８～１６细胞的克隆胚，将其胚胎细胞再移入成熟的去核卵母细胞，并进行电融合，构成Ｇ＿１代再克隆卵。１２９枚Ｇ＿０代克隆卵和１４３枚Ｇ＿１代再克隆卵移入同期发情的山羊输卵管，获得Ｇ＿０代克隆羊２只和Ｇ＿１代再克隆羊４只。介绍了产生克隆动物的各个技术环节以及这些环节与克隆动物出生率的关系。     

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

 【目的】本研究旨在探索一种崭新的、化学试剂诱导去核卵母细胞为核受体的、无透明带的、手工体细胞核移植方法。【方法】将第一次减数分裂期小鼠卵母细胞进行诱导去核并去除透明带，去核卵胞质与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后，体外培养重构胚。【结果】重构胚融合率和激活率分别为84.8％和93.6％；胚胎2-细胞发育率为24.7％，4-细胞率为6.74％；2-细胞期克隆胚移植假孕受体后，没有获得怀孕受体；分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植，结果表明，冷冻保存细胞的融合率（69.3％）与其余两组（80.6％和84.8％）呈显著差异（P＜0.05）；激活率、2-细胞和4-细胞发育率，则3组间差异不显著（P＞0.05）。【结论】本文将小鼠卵母细胞的化学去核与无透明带技术相结合，获得的克隆胚目前已发育到4－细胞期；另外，供体细胞的3种准备方式均不影响胚胎发育率。该方法属手工克隆，它的成功将会大大简化核移植程序，提高核移植总效率。     

体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究

[目的]探讨供体细胞类型、移植胚胎发育阶段、数量及部位对山羊转基因克隆效率的影响。[方法]利用体细胞核移植技术将转染人乳铁蛋白基因hLF的山羊胎儿成纤维细胞(GFF)和乳腺上皮细胞(GMGE)移植到MII期去核卵母细胞内,经电融合、激活、体外培养后,2~8细胞期克隆胚被移植到同期发情山羊的输卵管内,囊胚被移植到子宫角内。[结果]GFF与GMGE的妊娠率相近(输卵管移植妊娠率分别为26.47%及20.00%);在GFF,输卵管移植的妊娠率与子宫角内移植妊娠率接近(分别为26.47%及25.00%),输卵管移植胚胎平均数为21.2组的妊娠率显著高于5.93组和9.64组(40.00%及26.67%,21.43%)。[结论]供体细胞类型、移植胚胎的发育阶段及移植部位对山羊转基因克隆效率的影响不大,但对于输卵管移植,受体羊移植胚胎数量对妊娠率有明显的影响。此外,该研究还提示了利用成年羊乳腺上皮细胞制作转基因动物的可行性。     

羊胚胎生产和胚胎移植

综述了绵羊和山羊胚胎生产和胚胎移植各项技术的研究进展，包括超数排卵、体内受精与发育；成熟卵泡卵母细胞与腔前卵泡卵母细胞的体外成熟、体外受精与发育；利用极体生产胚胎以及利用胚胎生产胚胎的胚胎分割与细胞核移植克隆技术；胚胎的回收、检胚与胚胎分级，以及供体与受体的同期发情处理和胚胎移植技术。     

牛-山羊异种体细胞克隆胚胎线粒体形态超微结构观察

【目的】通过对正常受精胚胎、山羊同克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)以及牛-山羊异种克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)中线粒体超微结构的观察与比对,从亚细胞水平揭示异种克隆胚胎出现异常的原因,为异种克隆技术的进一步研究提供新思路。【方法】利用透射电镜分别对山羊正常受精胚胎、山羊同种克隆胚胎及牛-山羊异种克隆胚胎的原核、2-细胞、4-细胞、8-细胞及桑椹胚阶段的早期胚胎进行线粒体超微结构观察。【结果】山羊自然受精胚胎、山羊同种克隆胚胎的线粒体均为帽状,随着胚胎的发育,线粒体由电子密度高、嵴少的未成熟状态发育为电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体,而牛-山羊异种克隆胚胎从2-细胞胚胎至桑椹胚都存在一种具有多个分叶的线粒体,但这种形态异常的线粒体同样也能够形成电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体。【结论】牛卵母细胞与山羊体细胞之间不能有效的进行核-质互作,本研究中具体表现为出现多分叶形线粒体,从而影响牛-山羊异种克隆胚胎的发育。     

牛-山羊异种体细胞克隆胚胎线粒体形态超微结构观察#br#

 【目的】通过对正常受精胚胎、山羊同克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)以及牛-山羊异种克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)中线粒体超微结构的观察与比对,从亚细胞水平揭示异种克隆胚胎出现异常的原因,为异种克隆技术的进一步研究提供新思路。【方法】利用透射电镜分别对山羊正常受精胚胎、山羊同种克隆胚胎及牛-山羊异种克隆胚胎的原核、2-细胞、4-细胞、8-细胞及桑椹胚阶段的早期胚胎进行线粒体超微结构观察。【结果】山羊自然受精胚胎、山羊同种克隆胚胎的线粒体均为帽状,随着胚胎的发育,线粒体由电子密度高、嵴少的未成熟状态发育为电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体,而牛-山羊异种克隆胚胎从2-细胞胚胎至桑椹胚都存在一种具有多个分叶的线粒体,但这种形态异常的线粒体同样也能够形成电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体。【结论】牛卵母细胞与山羊体细胞之间不能有效的进行核-质互作,本研究中具体表现为出现多分叶形线粒体,从而影响牛-山羊异种克隆胚胎的发育。     

动物实验中显微操作针的制作

本文介绍了体细胞核移植、胞质内单精子注射等显微操作中所用针的种类（包括固定针、注射针、透明带切开法用的去核针和移核针以及一步法去核针）、制作方法及注意事项。     

EGF和不同血清对牛卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响

分离牛卵母细胞,分别用添加表皮生长因子(EGF)和发情牛血清(发情当天血清(OCS(0 d))和发情第7天血清(OCS(7 d)))的培养液进行成熟培养后去核,构建牛体细胞核移植胚并进行体外培养,研究EGF和OCS对卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响。结果表明EGF添加组和OCS(0 d)添加组卵细胞的成熟率及核移植胚的卵裂率和囊胚率分别为74.5%,84.6%,25.9%和83.9%,78.8%,31.3%。在牛卵母细胞成熟液中添加EGF、OCS(0 d)更有利于牛核移植胚胎的发育。     

提高绵羊繁殖率的新方法

澳大利亚畜牧专家研究成功一种大大提高绵羊繁殖率的新方法，可使绵羊繁殖羔羊由原来的每年12头增加到100头以上。其方法是：从母羊体内取出成熟的卵细胞，在实验室里使卵细胞受精，经过培养，其受精卵分离成32个细胞时再分离成32个游离体，然后分别接种到新的卵黄内，最后把这种有受精卵的细胞移植于发情母羊子宫内，使之完成正常妊娠，分娩出羊羔。