卵泡抑素样蛋白5基因在鹅肥肝形成中表达调控的研究

试验旨在探讨卵泡抑素样蛋白5(FSTL5)基因与鹅(Anser Cygnoides)肥肝形成的关系。试验选取30只健康、体重基本一致的70日龄朗德鹅,随机分为填饲组(15只)和对照组(15只)。在填饲到82日龄(填饲12 d)和94日龄(填饲24 d)时屠宰取样。此外,分离培养鹅原代肝细胞,并用葡萄糖、胰岛素和不同脂肪酸进行处理。结果显示:填饲后期肝脏和腹脂中FSTL5基因的表达量显著低于对照组(P<0.05),而胸肌中的表达量显著高于对照组(P<0.05)。在鹅原代肝细胞中,100 nmol/L胰岛素或0.25 mmol/L亚油酸能诱导FSTL5的表达(P<0.05)。综上所述,肝脏、脂肪与肌肉组织中的FSTL5表达在鹅肥肝形成后期受到显著影响,脂肪肝形成相关因子特别是胰岛素和亚油酸可诱导FSTL5的表达。研究结果为进一步研究FSTL5基因在鹅肥肝形成过程中的作用奠定了基础。     

IGFBP5基因与鹅肥肝形成及产量的关系研究

研究旨在揭示胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)基因与鹅脂肪肝(或肥肝)形成及产量的关系。对65日龄朗德鹅进行填饲或正常饲喂(自由采食),19 d后屠宰并测定填饲组和对照组(常规饲喂组)朗德鹅肝脏、腹脂和胸肌中IGFBP5基因的表达(n=5),以及分析IGFBP5多态性位点与鹅肥肝产量等指标的关联(n=120)。结果显示:相对于对照组,IGFBP5在填饲组三种组织中的表达量均显著减少(P0.05或P0.01),但在填饲过程中的表达变化因组织而异,或与组织中脂肪沉积量有关。在IGFBP5基因上游找到3个SNP,SNP2/3与肥肝重密切关联(P0.05),但编码区无多态性位点。表明IGFBP5参与鹅肥肝的形成,且可用作肥肝鹅的辅助选择标记。     

鹅乙酰辅酶A酰基转移酶2基因的克隆及其在鹅肥肝形成过程中的表达变化

为了探讨ACAA2基因与鹅(Anser anser)肝脂肪代谢的关系,本试验选取35只朗德鹅分为填饲组(15只)和对照组(20只),填饲组包括填饲7、14和19天3个阶段。运用RT-PCR方法克隆出朗德鹅ACAA2基因的完整编码序列并进行生物信息学分析,采用实时定量PCR技术测定了朗德鹅填饲不同阶段该基因在肝中的表达水平,并用葡萄糖、脂肪酸和胰岛素分别处理鹅原代肝细胞,观察这些因子对基因表达的影响。朗德鹅ACAA2基因完整CDS区长1 194bp,编码397个氨基酸;各阶段填饲组肝中该基因的表达量显著高于对照组(P0.05),但随填饲时间的延长,表达水平呈下降趋势。另外,在培养的鹅原代肝细胞中,相较于对照组,0.5mmol·L~(-1)的油酸能使ACAA2的表达量显著上调,而0.25mmol·L~(-1)的棕榈酸和不同浓度的胰岛素能显著下调ACAA2的表达(P0.05)。结果表明,ACAA2基因的表达与鹅肥肝的形成密切相关,为深入研究ACAA2基因在鹅肥肝形成过程中的作用奠定了基础。     

填饲和脂肪肝相关因子对鹅长非编码RNA基因(LOC106047490)表达的影响

长非编码RNA(lncRNA)是重要基因调节者,参与多种疾病的发生。本研究着重测定了填饲和脂肪肝相关因子对lncRNA基因(LOC106047490)表达的影响。在填饲7、14、19 d时,该基因在填饲鹅肝脏和腹脂中的表达均受到不同程度的抑制,而在胸肌仅第19天时有较明显的抑制。高葡萄糖、胰岛素和不饱和脂肪酸可在鹅原代肝细胞中诱导该基因的表达,但饱和脂肪酸无诱导作用。此外,在常规饲料中添加20%的蔗糖虽可提高鹅肥肝产量,但并不诱导该基因的表达。最后,本研究还发现该基因在鹅胚胎的肠和肌胃中表达最高,在肝和腿肌中表达最低。综上所述,LOC106047490在鹅肥肝形成过程中扮演重要角色,其表达受葡萄糖、胰岛素和不饱和脂肪酸影响,这为研究其功能提供了良好的体外模型。     

鹅肥肝形成中补体受体1基因的表达和调控研究

试验旨在探讨鹅补体受体1(CR1)基因在鹅肥肝形成中的表达和调控机制。通过荧光定量PCR验证CR1在填饲19 d鹅肝脏中的表达情况,通过体外细胞(鹅原代肝细胞)试验探索脂肪肝相关因子(葡萄糖、胰岛素、油酸和棕榈酸)对CR1的诱导作用,同时通过分析CR1基因的上游序列预测其转录调控因子并通过药物处理进行验证。结果发现,CR1基因在填饲19 d肥肝中的表达量显著高于对照组;25 mmol/L葡萄糖以及各处理浓度的油酸(0.125、0.25和0.5 mmol/L)均可导致鹅原代肝细胞中CR1表达水平的显著上调,胰岛素对CR1的表达水平没有显著影响,而0.5 mmol/L棕榈酸则对CR1在鹅原代肝细胞中的表达有一定的抑制作用;序列分析发现,鹅CR1上游序列含有肝细胞核因子1(HNF1)的结合位点,且使用HNF1的活性调控剂(鹅去氧胆酸)处理鹅原代肝细胞后,鹅CR1基因的表达量显著上调。综上,本研究证实CR1基因在鹅肥肝形成过程中表达水平的显著上调,并对其可能的调控机制进行初步探索,为深入研究补体系统在鹅肥肝形成中的作用和机制奠定了基础。     

鹅乙酰辅酶A酰基转移酶1基因的克隆、表达及生物信息分析

本实验旨在探究鹅乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)基因的分子结构和功能特性,及其在鹅肥肝形成过程肝脏中的表达变化。选用体型和体重相当的70日龄健康朗德鹅42只,正常填饲,填饲到21 d转为限制饲养。然后分别在填饲前(OF0)、填饲第7天(OF7)、填饲第14天(OF14)、填饲第21天(OF21)、限制饲养第7天(F7)、限制饲养第14天(F14)和限制饲养第21天(F21)7个填饲阶段各采集6只鹅肝脏组织样本;采用RT-PCR和RACE方法克隆获得朗德鹅ACAA1基因cDNA全长序列并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法检测ACAA1基因在朗德鹅不同填饲阶段肝脏中的表达。结果表明:鹅ACAA1基因cDNA全长为3 352 bp,其中CDS区为1 323 bp,5'UTR长度为77 bp,3'UTR长度为1 952 bp,编码441个氨基酸;在朗德鹅肥肝形成过程中,ACAA1基因在肝脏中的表达量呈先上升后下降的趋势,其在填饲14 d的鹅肝脏中表达量最高(P0.05),在填饲结束限饲阶段的鹅肝脏中表达最低(P0.05),限饲到21 d,其表达量恢复到填饲前水平。结果提示,ACAA1基因的表达与鹅肥肝的形成密切相关,为研究ACAA1基因在鹅肥肝形成中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

卵巢肿瘤去泛素化酶7A基因与鹅肥肝形成关系的研究

【目的】 研究卵巢肿瘤去泛素化酶7A(OTUD7A)基因与鹅肥肝形成的关系。【方法】 选取健康、体重一致的70日龄朗德鹅公鹅40只,随机分为2组,对照组自由采食,试验组进行填饲试验,其中填饲第1~5天每日采食量为500 g,第6~12天每日采食量为800 g,第13~19天每日采食量为1 200 g。在填饲第7、14和19天时,每组随机选取6只鹅屠宰,取肝脏,采用实时荧光定量PCR测定不同填饲阶段肝脏中OTUD7A基因的表达水平。采用Ⅳ型胶原酶消化法分离23胚龄的鹅原代肝细胞,分别用浓度为0(空白组)、125、250 mmol/L的葡萄糖,0(空白组)、50、100、200 nmol/L的胰岛素,0(空白组)、0.125、0.250 mmol/L的油酸、亚油酸及0(空白组)、0.25、0.50 mmol/L棕榈酸处理鹅原代肝细胞,并用实时荧光定量PCR检测这些脂肪肝形成相关因子对OTUD7A基因表达水平的影响。构建过表达OTUD7A基因的载体pcDNA3.1-OTUD7A,并将构建好的过表达重组质粒转染鹅原代肝细胞,通过转录组学测序(RNA-Seq)进行差异表达基因的筛选,并对获得的差异表达基因进行GO功能富集分析。【结果】 在填饲第7、14天时,鹅肝脏中的OTUD7A基因表达显著高于对照组(P<0.05)。与空白组相比,250 mmol/L葡萄糖处理以及0.125 mmol/L和0.250 mmol/L棕榈酸处理均显著提高鹅原代肝细胞中OTUD7A基因的表达水平(P<0.05)。转录组学测序结果表明,OTUD7A基因过表达后共筛选到34个差异表达基因,其中有19个基因表达上调、15个基因表达下调。GO功能富集分析发现,差异表达基因注释到对微生物的防御反应、对外界生物刺激的反应、T细胞分化、细胞外外泌体等条目,其中CLMP、PROCR、SH3BP1、ARHGAP28、ACE、OTUD7A、LOC106045877、LOC106048002基因的表达上调,TNFSF8、DDX60、PLAC8、RSAD2、MX1、RSAD2、GBP1基因的表达下调。【结论】 鹅肥肝形成过程中OTUD7A基因的表达水平升高,OTUD7A基因可能通过调控TNFSF8、RSAD2、MX1、GBP1、CLMP和PROCR等基因的表达参与鹅肥肝的形成。     

鹅ACSL1基因克隆及其在鹅肥肝形成中作用的初步研究

本研究旨在克隆鹅长链酯酰辅酶A合成酶1(ACSL1)基因,并研究其在填饲诱导鹅肥肝形成中的作用,为揭示ACSL1在鹅肥肝形成过程中的作用提供依据。以前期抑制消减杂交文库筛选的部分ESTs序列为基础,通过RT-PCR扩增鹅ACSL1基因CDS、并用实时定量等技术检测该基因在皮脂、腹脂、肝脏等10个组织中的表达情况及填饲对其在肝脏中表达的影响,同时与填饲后鹅肝脏总脂质、甘油三酯(TG)、肝质量等指标进行相关分析。结果发现:鹅ACSL1基因CDS全长2100bp,编码699个氨基酸。保守结构区预测发现,其蛋白质跟其他物种一样,也存在2个保守功能区(ATP/AMPmotif和FACSmotif)和1个跨膜结构域,它与鸡、牛、人、小鼠ACSL1基因的同源性分别为93%、80.4%、78.5%、77.3%;该基因主要表达于腹脂、皮脂、肝脏,而在其他组织表达相对较低;填饲能引起ACSL1mRNA在鹅肝脏的表达丰度极显著增加(P0.01),且与肝质量、肝内TG和总脂质呈显著正相关;同时,填饲导致其在朗德鹅肝脏中的表达丰度显著高于四川白鹅(P0.05)。结果提示:填饲引起ACSL1mR-NA在鹅肝脏中极显著增加(P0.01),且其增加幅度存在着品种间差异(P0.05)。     

填饲对鹅胰岛素样生长因子结合蛋白2基因表达的影响

研究旨在探讨填饲对朗德鹅胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)基因在肝脏、胸肌和腹脂中表达的影响,将30只70日龄朗德鹅分为填饲组(15只)和对照组(15只),分别于77(填饲7 d)、84(填饲14 d)和89(填饲19 d)日龄采集填饲组和对照组的组织样本。采用实时荧光定量PCR法测定朗德鹅不同填饲阶段IGFBP2基因在肝脏、胸肌和腹脂中的表达情况。结果发现:各阶段填饲组肝脏中IGFBP2基因的表达量显著低于对照组(P0.05),且随着填饲时间的延长,表达水平下降趋势更加显著;胸肌中IGFBP2基因的表达量在填饲的第7和19天与对照组相当,而在第14天则显著低于对照组(P0.05);腹脂中IGFBP2基因的表达量在填饲的第7天和第14天显著低于对照组(P0.05),而在填饲第19天时,IGFBP2基因的表达量在填饲组与对照组间差异不显著。结果表明,IGFBP2基因的表达与鹅肥肝的形成密切相关,为深入研究IGFBP2基因在肥肝形成过程中的作用奠定基础。     

鹅DHRS7基因克隆、序列分析及其在鹅肥肝形成过程中的表达特点

为获得鹅DHRS7基因全长cDNA,并探讨该基因是否参与鹅肥肝的形成过程。本研究应用抑制消减杂交文库获得鹅DHRS7基因部分EST序列,采用RACE技术扩增了鹅该基因全长cDNA,并对其序列进行了生物信息分析;用荧光定量PCR技术检测了DHRS7在鹅肝脏、皮脂、腹脂等10个组织中的差异表达,以及填饲对鹅肝脏中DHRS7表达变化的影响。结果发现,鹅DHRS7基因cDNA全长1 279bp,含一个完整的开放阅读框1 011bp(可编码336个氨基酸),25bp的5′UTR和243bp的3′UTR序列;生物信息学分析结果显示,鹅DHRS7含有跨膜结构域以及NADP结合位点,且在这些功能区域变异较少;荧光定量结果显示,DHRS7在鹅肝脏和脂肪组织中都有较高表达,填饲后鹅肝脏中DHRS7的表达水平显著上调(P<0.05)。以上结果表明,DHRS7在鹅肥肝形成过程中具有重要的作用。     

构树不同部位与奶牛常用粗饲料瘤胃降解特性对比研究

本试验旨在研究构树不同部位(构树叶、构树枝叶、构树枝)与奶牛常用粗饲料(苜蓿干草、燕麦草)的瘤胃降解特性。选用3只装有永久性瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛,采用尼龙袋法测定5种饲料的干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)瘤胃降解规律。结果表明:1)构树叶的CP含量显著高于苜蓿干草(P<0.05),NDF含量显著低于苜蓿干草(P<0.05);构树枝叶的CP含量与苜蓿干草差异不显著(P>0.05),NDF含量显著低于苜蓿干草(P<0.05);构树枝的CP含量与燕麦草差异不显著(P>0.05),NDF含量显著高于燕麦草(P<0.05)。2)5种饲料的DM有效降解率差异显著(P<0.05),由高到低依次为构树叶、构树枝叶、苜蓿干草、燕麦草和构树枝。5种饲料的CP有效降解率差异显著(P<0.05),由高到低依次为苜蓿干草、构树叶、构树枝叶、燕麦草和构树枝。构树叶的NDF有效降解率最高,显著高于其他4种饲料(P<0.05),其中构树枝叶与燕麦草差异不显著(P>0.05)。5种饲料的ADF有效降解率差异显著(P<0.05),由高到低依次为构树叶、燕麦草、苜蓿干草、构树枝叶和构树枝。综上所述,构树不同部位具有作为奶牛非常规饲料资源的潜力。     

表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组杆状病毒疫苗候选株的构建与免疫效果评估

为了有效防控H7N9亚型禽流感疫情,研制能够预防高致病性H7N9亚型禽流感的疫苗非常必要。研究基于昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS),构建并拯救了一株表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)的重组杆状病毒rBac-GD15HA。间接免疫荧光试验及免疫印迹试验鉴定结果表明rBac-GD15HA的HA蛋白在Sf9细胞中成功表达;重组病毒细胞传代试验结果表明rBac-GD15HA在传代过程中能保持较高的病毒滴度,且遗传稳定;鸡的免疫试验结果显示,重组疫苗在一次免疫后即能诱导较高水平的针对H7N9 AIV的抗体应答,并能提供针对高致病性H7N9 AIV 100%的临床保护。因此,研究结果可作为H7N9亚型禽流感疫苗研发策略的参考,为其防控提供一种安全有效的方法,也为今后广谱流感疫苗的研发奠定一定的基础。     

驴源马流产沙门菌的耐药表型及毒力基因检测

为了解驴源马流产沙门菌临床分离株的耐药表型及毒力基因的携带情况,本试验通过K-B药敏纸片扩散法对9株马流产沙门菌进行11种临床常用抗菌药物的敏感性测试,采用PCR方法检测与沙门菌致病性相关的10种毒力基因。结果显示:9株驴源马流产沙门菌存在2种耐药表型,对链霉素耐药率达100%,对阿莫西林耐药率为33%;10种毒力基因中仅traT未被检出,invA、avrA、ssaQ、mgtC、sopB、spvC、spvR、pefA和misL的检出率均为100%。结果表明,驴源马流产沙门菌耐药谱较为单一,但携带的毒力基因为多样性组合。     

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫组化试验中的初步应用

为制备猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白单克隆抗体(MAb),并初步应用于感染细胞或组织样品中PCV3抗原的间接免疫荧光试验(IFA)或免疫组化(IHC)检测,本研究将PCV3 Cap蛋白的去核定位信号肽基因克隆于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导表达了具有免疫原性的融合蛋白。以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,共获得8株能够稳定分泌针对PCV3 Cap蛋白的MAb杂交瘤细胞株。Western blot与IFA试验结果显示,8株MAbs均能够与真核表达的重组Cap蛋白反应。选取3株杂交瘤细胞制备3株MAbs,小鼠腹水效价分别为1∶409 600、1∶204 800和1∶409 600。利用3株MAbs对自然感染PCV3临床病猪的腹股沟淋巴结进行IHC检测,结果显示3株MAbs的腹水均能够与感染PCV3的临床样品发生特异性的免疫反应。本研究制备的MAbs具有较好的特异性,为深入研究Cap蛋白的结构和PCV3快速诊断奠定了基础。     

低水平镉暴露对破骨细胞分化的影响

为研究低水平镉(Cd)暴露对破骨细胞(osteoclast,OC)分化的影响,试验以RAW264.7细胞(单核巨噬细胞系)为材料,在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)存在的条件下,用不同浓度Cd处理4 d;利用CCK-8法检测破骨细胞及其前体细胞活性变化,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试验观察破骨细胞生成,激光共聚焦显微镜观察破骨细胞形态变化,蛋白免疫印迹(Western blot)技术和荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测破骨细胞标志性蛋白及其mRNA水平。结果显示,随着Cd浓度升高,细胞活力受到明显的抑制(P<0.01),并呈浓度-效应关系;与对照组相比,破骨细胞产生的数目和面积均显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);2、5μmol·L^-1 Cd处理组破骨细胞封闭带的形成均受到抑制;2和5μmol·L^-1 Cd处理组破骨细胞特异性蛋白及其mRNA表达量均显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),并呈剂量依赖性。结果表明,低微摩尔水平镉暴露能够抑制破骨细胞的分化。     

玉米赤霉烯酮对小鼠原代培养T淋巴细胞细胞因子分泌的影响

为探讨玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对动物免疫功能的影响及其机理,试验以分离培养的原代小鼠脾脏淋巴细胞材料,研究了ZEA对T淋巴细胞细胞因子分泌的影响。以刀豆蛋白A(Con A,5 mg/L)作为T细胞活化特异性刺激剂,试验设空白对照组(不加Con A)、Con A组(5 mg/L Con A)、不同浓度的ZEA染毒组(Con A+ZEA 10、20和40μmol/L),处理48,72 h后,使用流式液相多重蛋白定量技术检测T细胞分泌IL-2、IL-3、IL-5、IL-6和GM-CSF等细胞因子的含量。结果显示,与空白对照组相比,Con A组细胞在48,72 h时间段5种细胞因子分泌均明显上升;与Con A组比较,染毒48,72 h后,10,20,40μmol/L ZEA染毒组各细胞因子分泌浓度均有极显著下降(P<0.01),并呈剂量-效应关系。结果表明,ZEA可以抑制T淋巴细胞细胞因子IL-2、IL-3、IL-5、IL-6和GM-CSF的分泌,从而影响机体正常免疫反应的进行,降低整体的免疫功能。     

2017—2018年华东地区H9亚型禽流感病毒分离毒株的抗原差异分析

为掌握华东地区H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的流行情况及变异程度,采集临床疑似病料和活禽交易市场家禽的棉拭子样品,通过鸡胚接种、HA和HI试验及RT-PCR等方法分离鉴定H9 AIV,对其中部分毒株进行测序和序列分析,筛选4个代表毒株免疫SPF鸡制备抗血清,利用交叉血凝抑制试验测定抗原差异性。结果如下:共分离鉴定出62株H9亚型禽流感病毒,分离率为2.02%(62/3 074)。对25株H9亚型禽流感病毒株序列分析发现,分离株属于h9.4.2.5谱系,并进一步细分为A和B亚系。 HA 基因裂解位点氨基酸为PSRSSR↓G,符合低致病性禽流感病毒的特征。与Y280代表株 HA 基因的推导氨基酸相比,分离株受体结合位点左侧臂全部变为NGLMGR。在抗原位点92位氨基酸出现R(64%)/K(36%)的变化。交叉血凝抑制试验结果表明分离株间的HI抗体滴度相差2~8 log2,可分为2类抗原型。因此,目前流行的H9亚型AIV发生了抗原变异,至少同时存在两种抗原型。     

玉米赤霉烯酮对趋化因子诱导的小鼠T细胞迁移效应和黏附与迁移相关蛋白表达的影响

为揭示玉米赤霉烯酮(ZEA)免疫毒性机理,通过体外试验研究了ZEA对趋化因子诱导的小鼠T细胞迁移效应的影响,以及这一过程中与细胞黏附与迁移相关蛋白的变化。以ConA作为T细胞活化剂,以不同浓度ZEA(0、10、20、40μmol/L)染毒处理细胞后,Transwell法检测T细胞分别在CCL19、CCL21作用下的迁移效应,以及利用流式细胞术检测迁移后CD4、CD8阳性T细胞所占比例。激光共聚焦显微镜拍摄细胞穿膜形态,Western blot检测T细胞迁移及细胞黏附相关蛋白的表达。结果显示,ZEA可以分别降低CCL19和CCL21趋化的T细胞的迁移指数并扰乱迁移后CD4、CD8阳性T细胞之间的比例。此外,ZEA可以不同程度地抑制CCL19和CCL21介导的T细胞穿膜效应。Western blot结果显示,20、40μmol/L的ZEA作用可下调T细胞迁移及细胞黏附相关蛋白的表达。结果表明,ZEA可以抑制趋化因子介导的T细胞迁移效应,在这一过程中,黏附蛋白及迁移蛋白的表达均受到抑制,提示ZEA可能通过抑制T细胞运动过程中黏附及迁移这两个环节,进而影响T细胞的免疫应答,从而发挥免疫抑制作用。     

反刍动物瘤胃内乳酸代谢与瘤胃酸中毒调控的研究进展

乳酸是反刍动物瘤胃内重要的中间代谢产物,在饲喂高精料的反刍动物瘤胃内乳酸累积过多可能会加速瘤胃酸中毒的进程。本文综述了瘤胃内乳酸代谢机制和影响因素,以及提高乳酸利用和添加硫胺素等预防瘤胃酸中毒的几种方式,旨在系统地总结反刍动物瘤胃内乳酸代谢机制,为瘤胃酸中毒的调控提供理论支撑。