猪精子结合和内化外源基因的影响因素研究

精子介导基因转移(SMGT)是目前转基因动物研究中简单而高效的方法之一,其中精子结合和内化外源基因的效率是精子介导转基因成功的关键.本试验以DIG标记的线性化EGFP作为示踪基因来检测猪精子结合和内化外源基因的影响因素,结果表明:猪精子能够自发结合外源基因,结合部位主要在精子顶体后区.精子结合外源DNA的阳性率随共孵育时间延长而增加,在37℃或39℃时孵育60 min后,阳性率不再增加;在17℃时孵育90min后,阳性率不再增加.在检查的15只公猪样本中,精子与外源DNA的结合率为6.57%～35.81%,内化率为2.99%～24.66%,个体间差异显著(P<0.01).精浆能够强烈抑制外源基因的结合和内化,脂质体及DMSO能够显著提高转染效率.死精子能够结合外源基因,但不能将其内化;反复冻融导致质膜破裂的精子对外源基因有更高的结合率,且不受个体影响.     

精子载体转基因技术的最新研究进展

用动物精子作为外源DNA载体已成为转基因的主要方法之一,并在多种动物上获得成功.最近,人们对外源DNA与精子结合的分子机理进行深入研究发现外源DNA可与精子膜上30～35 kDa蛋白质特异结合,结合强度受精子膜上MHCII因子的调节.精清中的IF-1因子能抑制精子结合外源DNA,从而维持物种的遗传稳定性.精子结合外源DNA的量是恒定的,部分DNA能进入精子核内,CD4蛋白具有转运外源DNA进入精子核内的功能.进入核内的外源DNA牢固结合在精子核骨架上,然后整合到染色体的特异位点.但是,精子与外源DNA结合后能激活精子内的核酸酶,进而使外源DNA分子降解,可能是导致这种转基因方法稳定性差的主要原因.     

精子载体转基因技术研究进展

精子因在受精过程中的独特作用,而被公认为是转移外源DNA的理想载体,且操作简便,成本低廉,危险隐患相对较低,近十几年来的研究结果表明精子载体介导法可以得到转基因阳性动物.本文对精子载体转基因方法、精子载体转基因的机理、影响精子与外源DNA结合的因素以及外源DNA在宿主动物中的存在形式等方面进行了论述,并对精子作为载体的研究方向和前景给予了预测.     

精子作为外源基因载体的转基因方法研究进展

以精子为载体的转基因动物制作方法巳引起众多研究者的关注与青睐。近年来此法的研究巳取得较大进展，并在多种动物上获得成功。随着对精子载体法的深入研究，外源DNA与精子结合的方法也不断改进。作者就精子与外源DNA体内、体外的结合方法作一综述。     

精子载体法转基因技术研究进展

精子载体法是以精子作为外源基因的载体,在受精过程中将外源基因导入动物胚胎,从而使外源基因进入子代的基因组中。作者就精子结合外源基因的机制,精子与外源基因结合的方法、影响精子转染外源基因和生产转基因动物的精子因素进行简要介绍,并对发展起来的输精管内注射转染法、曲细精管微注射法和睾丸直接注射法等精子载体转基因新途径进行综述。     

影响猪精子介导基因转移效果的因素研究

为优化猪精子载体法技术参数,利用荧光定量PCR、荧光显微镜检测和精液常规检测方法,分析不同DNA转染剂、不同孵育温度和不同形态DNA对猪精子转染外源DNA的影响。结果表明,PEI和TransFast转染剂能极显著提高猪精子转染效果,且PEI优于TransFast,而NanoFect转染剂包裹DNA不能转染精子。随着转染温度的升高,精子的活力和活率均明显下降,而转染率和内化外源DNA量基本保持稳定,而吸附外源DNA量呈下降趋势。环状DNA和线性化DNA在与精子共孵育后,两者的精子活力、活率、转染率和内化外源DNA量差异均不显著,精子吸附线性化DNA量极显著高于环状DNA量。综合分析表明,外源DNA形态对猪精子转染效果无显著影响;PEI和TransFast能够显著提高猪精子转染效果;共孵育温度以17℃为最佳,本结果为开展精子载体法制备转基因猪研究提供了基础试验依据。     

精子载体法获得转人her2基因猪

将带有外源基因的载体酶切纯化后与去精清的猪新鲜精液按比例混合，17℃静置处理使外源DNA进入精子头部，通过人工授精使受体母猪怀孕后产下20头仔猪，经PCR特异性片段扩增，特异片段序列测定和比对，共4头PCR结果为阳性。初步证明人her2基因已在猪染色体上整合，其整合率约为20％。本研究利用精子载体法成功获得了转基因阳性猪，为大动物的转基因研究提供了理论与实践的参考。     

转基因动物制备方法

动物转基因技术是通过将外源性目的基因整合到动物染色体上,使其在体内整合和表达,获得表达外源基因动物的技术。该技术广泛应用于转基因动物育种、基因功能研究、药用蛋白生产和器官移植等方面。其主要方法包括逆转录病毒感染法、显微注射法、体细胞核移植法、胚胎干细胞介导法、精子介导法等。本文旨在对动物转基因的各种技术和方法进行综述,甄别各自的优缺点,为科研工作者提供一定的参考。     

精子介导外源DNA转移的研究进展

精子因在受精过程中的独特作用,而被认为是转移外源ＤＮＡ的理想载体。本文对精子作载体进行转基因动物制作的方法、外源ＤＮＡ与精子作用的分子机制、导入动物个体或胚胎的外源ＤＮＡ的存在形式、影响精子与外源ＤＮＡ结合的因素进行了论述,并对精子作为载体的研究方向和发展前景给予了预测。     

禽类转基因生产及其应用的研究现状和进展

1.7 精子载体转基因法（Sperm mediated gene transfer) 1.7.1 辐射精子作载体法 Pandoy和Patchell用致死剂量辐射带有选择标记的鸡精液进行授精（制造假妊娠），然后再用同种精液进行正常受精，以此来进行品种标记基因的转导。该试验以羽色和蛋壳色基因为标记，用此法在后代中获得3.5%的后代可表达外源基因。这种方法可以准确地使DNA进入核内，同时解决分离、提供插入所需基因的困难，但是无特异性，遗传频率不能预知，而且会导入不需要的基因。Bumstead［6］从对马立克氏病敏感和淋巴白血病抗性的母鸡得到转基因鸡，发现这种转基因鸡蛋对两种疾病都表现敏感而不表现抗性。这一实验直接证实了辐射精子发生非特异性整合的事实。 1.7.2 精子载体法 在禽类中精子载体转基因法能够在子代中获得1/300的携带外源基因个体。1990年法国国立发育生物学研究所的以色列研究者用此法导入外源基因，用Southern杂交法检测出阳性个体。但是至今未能获得F1代。Gruenbaum等以LacZ和CAT作为标记基因，用吸附该基因的鸡精子进行人工授精，对获得的胚胎及雏鸡进行Southern杂交和PCR分析，结果在所检测样本中30%～60%整合有外源DNA，在部分组织中检测到外源基因表达产物，在传代试验中，证明外源DNA能遗传给后代。Squries等根据精细膜的特性和相似相溶原理，用脂质体包装外源DNA与精子共同孵育，然后进行人工授精，在鸡上获得成功，阳性率为15%～25%。