GnRH脉冲对体外原代培养大鼠GTH细胞中FSHβ mRNA表达水平的影响

为了从分子水平阐述不同脉冲频率促性腺激素释放激素(GnRH)对促性腺激素(GTH)分泌促卵泡素(FSH)的影响,采用细胞体外培养技术结合荧光定量PCR技术,研究体外培养大鼠原代垂体细胞在不同脉冲频率GnRH刺激下,细胞FSHβ mRNA的变化.在相同振幅条件下,低频刺激(120 min间隔)时,FSHβ mRNA表达水...     

兴奋或抑制细胞内PKC或cAMP对不同脉冲频率GnRH刺激下GTH表达水平的影响

观察兴奋或抑制细胞内cAMP和PKC后,LH和FSH对不同脉冲频率GnRH刺激的应答情况,分析LH/FSH表达的受体后信号转导机制。结果表明,使用cAMP的兴奋剂或抑制剂使细胞cAMP含量升高或降低时,显著影响了LH的应答,但对FSH的应答影响不显著;使用PKC的兴奋剂或抑制剂使细胞PKC活性升高或降低时,既显著影响了LH的应答,也显著影响了FSH的应答。两者均随着PKC活性的升降而升降。     

大鼠GTH细胞PKC对FSH-β mRNA表达的影响

为研究大鼠促卵泡素(FSH)分泌的受体后信号转导机制,将GTH细胞用PMA或H7处理后,用GnRH脉冲刺激,再用实时荧光定量PCR方法测定细胞FSH-βmRNA表达的Ct值,并与空白对照组比较。结果表明,PMA能显著降低GTH细胞FSH-βmRNA表达的Ct值,H7则曾能显著升高,说明GTH细胞PKC活性显著影响FSH-βmRNA的表达,FSH-βmRNA的表达随着PKC活性的升高而显著升高,随着PKC活性的降低而显著降低。因此,PKC-Ca2+是GnRH脉冲刺激所引起的FSH-βmRNA表达的受体后的信号转导途径。     

鸡Th1样淋巴因子mRNA的体外表达

应用RT－PCR技术研究了鸡脾细胞在体外受到丝分裂原ConA的刺激后，其Th1样淋巴因子的体外表达动态，结果表明，鸡脾细胸在ConA诱导培养1，2，3，4，8，12，24h后，均表达a-干扰素mRNA,且未经有丝分裂原刺激的脾细胞以及诱导但培养了3，8，48h的脾细胞，也表达a-干扰 素mRNA,r-干扰素在上述诱导培养时，其mRNA均发生表达，未经有丝分裂原刺激的脾细胞培养3，8h时，也表达r-干扰素mRNA, 但培养48h时则未检测到，未受有丝分裂原刺激的细胞不表达r－干扰素mRNA，鸡白细胞介质－2mRNA仅在刺激2，3，4，8，12，24，48h时表达，在其他情况下则未检测到，本研究还发现1种与已报道的鸡a-干扰素序列不同的基因，但基体外的表达动态类似于鸡a-干扰素，上述研究表明，鸡Th1样淋巴子的体外表达类似于哺乳动物，但也存在一定的差异。     

受精素β基因mRNA在绵羊睾丸组织中的表达

利用RT-PCR法和原位杂交技术，研究受精素β mRNA在睾丸和附睾中的表达特征。结果显示，受精素β mRNA只有在睾丸组织中表达，并且主要分布在精细管上皮圆形精细胞中，而附睾不同部位均无表达。上述结果表明，受精素β mRNA是睾丸特异性表达的精子膜蛋白。     

猪Akirin2基因的定位及其影响IL-1β和IL-6mRNA表达的研究

本研究旨在研究猪新天然免疫相关基因Akirin2所表达的蛋白在细胞中的定位,以及在受到外源刺激物LPS刺激时,对细胞因子IL-6和IL-1β mRNA表达的影响.本试验用实验室构建好的pEGFP-Akirin2真核表达载体转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),用激光共聚焦显微镜分析Akirin2在SUVEC的定位,并用LPS作为外源刺激物刺激转染Akirin2基因的细胞,荧光实时定量分析细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量的变化.结果表明,Akirin2基因编码的蛋白严格定位于细胞核之内,并在核仁区有明显表达,在LPS刺激后,Akirin2基因对细胞因子IL-6和IL-1β mRNA表达量都具有明显上调作用.本研究证实了Akirin2蛋白的亚细胞定位及其对细胞因子表达的影响,为Akirin2基因的作用机制的进一步研究奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先,在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞,然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激,利用荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)从mRNA水平检测刺激后上皮细胞中绵羊β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1,SBD-1)基因表达水平的差异。结果表明:当菌液浓度为1010 cfu·mL-1刺激上皮细胞8h后,SBD-1的表达量达到最高;不同的菌液浓度诱导下SBD-1的表达量均有显著增加,109、1010、1011 cfu·mL-1菌液浓度刺激下,SBD-1的表达量与空白相比差异极显著(P0.01)。结果表明,枯草芽孢杆菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的表达。     

初情期前母猪垂体细胞LH和FSH的释放及其对GnRH类似物的反应

利用垂体细胞单层培养模型研究了30，60，90，120和150日龄北京黑猪母猪垂体细胞LH和FSH的释放及其对LRH－A3反应能力。结果表明，猪垂体细胞LH和FSH释放对LRH－A3的反应呈S形剂量依赖型同线。LH基础释放量和LRH－A3刺激的最大释放量在不同日龄间没有显著差异，说明初情期前母猪垂体细胞已达最大LH释放和对GnRH反应的能力。FSH的基础释放量和LRH－A3刺激的最在释放量在30日龄与60日龄之间无差异，但90日龄以后垂体细胞FSH的释施量随日龄增大而降低，提出可能由于垂体在体内时受过抑制素的作用。     

初情期启动过程中小尾寒羊下丘脑GnRH基因甲基化状态及表达量关系研究

初情期启动的早晚关系到雌性动物的繁殖性能,GnRH是动物初情期启动过程中的关键基因,其启动子区甲基化状态与GnRH mRNA表达量之间的关系尚不清楚。本研究选择初情期前、临近初情期和初情期雌性小尾寒羊的下丘脑作为样本,利用亚硫酸氢盐测序(BSP)技术和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了初情期不同阶段小尾寒羊GnRH启动子区的甲基化状态和GnRH mRNA的表达量,并分析二者之间的关系。结果表明:小尾寒羊到达初情期时,GnRH基因启动子区甲基化水平显著降低(P0.05),尤其是在启动子区-570位点降低最明显,而随着初情期的启动GnRH mRNA表达量呈上升趋势。结果提示,初情期启动过程中,GnRH mRNA表达量升高可能与下丘脑GnRH基因启动子区特定位点甲基化水平降低存在一定的关系。     

卵泡FSH受体mRNA的表达及其对卵母细胞体外培养成熟率的影响

本研究采用RT-PCR技术检测了猪大、中、小卵泡颗粒细胞中FSH受体(FSHR)mRNA的表达差异,比较和分析了受体表达差异及其对卵母细胞体外成熟培养的影响。结果表明大、中、小卵泡中颗粒细胞都有FSHR mRNA表达,大卵泡的颗粒细胞与小、中卵泡的颗粒细胞FSHR mRNA相对表达量有显著差异(P<0.05),中、小卵泡的颗粒细胞FSHR mRNA相对表达量之间无显著差异(P>0.05)。不同大小卵泡卵母细胞体外成熟培养结果表明,小卵泡与大、中卵泡比较,卵丘细胞扩展率和第一极体排出率差异显著(P<0.05)。这表明猪不同大小卵泡颗粒细胞FSHR mRNA的表达量与其卵母细胞体外培养成熟率呈相关性,进一步证实FSHR在猪卵泡及卵母细胞发育中起着重要作用。     

氟对体外培养绵羊成骨细胞RANKL mRNA基因表达影响

为了探讨氟对体外培养的绵羊成骨细胞中核因子кB受体活化因子配体(RANKL)mRNA基因表达的影响,进行了绵羊成骨细胞体外培养,分别加入含浓度为0、10-6、10-5、10-4、5×10-4mol/L氟化钠(NaF)的培养液,并于第6天提取细胞总mRNA,用半定量RT-PCR方法分析RANKL mRNA表达水平的改变.结果表明,10-6、10-5、10-4、5×10-4 mol/L NaF均能刺激体外培养成骨细胞RANKL mRNA表达,当氟化钠浓度为10-5及5×10-4 mol/L时,可以明显促进RANKL mRNA表达(与对照组相比P＜0.01).这说明氟呈剂量依赖性地刺激成骨细胞RANKLmRNA的表达.     

两种不同刺激剂对鸡淋巴细胞分泌细胞因子的影响

[目的]比较不同刺激剂刀豆素A(ConA)和植物凝素(PHA)对鸡淋巴细胞分泌细胞因子的影响。[方法]首先,应用淋巴细胞分离液分离健康鸡的外周血淋巴细胞,应用2种不同的刺激剂ConA和PHA刺激48 h后收集细胞,抽提刺激培养细胞RNA,反转录。其次,应用实时定量PCR方法检测不同刺激剂对鸡淋巴细胞因子mRNA的表达。最后,用分子生物学软件对数据进行比对分析。[结果 ]分离到纯度和活细胞较高的鸡淋巴细胞。荧光定量PCR结果显示:ConA刺激的淋巴细胞因子表达量比PHA刺激细胞的表达量明显升高(P0.01);PHA刺激的细胞因子除IL-4的表达量明显升高(P0.01)外,其他细胞因子表达量无明显升高(P0.05)。[结论 ]ConA刺激淋巴细胞后,可以提高细胞因子的表达,刺激效果优于PHA。这些实验结果为进一步体外研究鸡淋巴细胞及其功能提供了方法。     

牛垂体细胞体外培养条件下催乳素分泌的调节—TRH、 GnRH、LH和PRL的影响

利用牛垂体细胞体外无血清培养技术,研究了促甲状腺素释放素(TRH)、促性腺激素释放素(GnRH)、促黄体激素(LH)和催乳素(PRL)对牛垂体细胞PRL分泌的调节。细胞在培养箱内预培养24小时后开始各项处理,以后隔24小时采集培养液一次,并换新的相同处理的培养液。结果表明:GnRH和TRH在第一次处理时均能显著增加PRL的分泌。加入1、10、100ng/ml的GnRH可使PRL分泌量分别增加53％(P<0.05)、111％(P<0.01)和60％(P<0.01),而TRH只有在10、100ng/ml的剂量时明显引起PRL释放增加(P<0.01)。第二次处理时细胞对TRH的反应消失,但对GnRH的反应却发生了逆转,PRL分别降低了70％(P<0.05)、68％(P<0.05)和73％(P<0.05)。表明GnRH和TRH在培养初期具有促进垂体细胞释放PRL的作用。LH(1、10、100ng/ml)对牛垂体细胞PRL的分泌无影响。但LH和TRH合用时,100ng/ml LH可明显地降低由TRH引起的PRL分泌(P<0.05)。PRL本身对牛垂体细胞的分泌有自我调节作用,100、1000ng/ml的PRL处理细胞使其分泌的PRL显著下降,分别降低70％(P<0.05)和100％(P<0.001)。此外1000ng/ml的PRL可显著地抑制由GnRH在第一次处理时引起的PRL释放。本实验在垂体细胞水平说明多种激素对PRL的分泌调节具有调控作用。     

脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表达的影响

本试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究不同浓度脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞时IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表达情况。结果显示,LPS浓度为10μg/mL时刺激效果最好;10μg/mL LPS刺激后24h,IL-6和IL-8的表达量最高(P0.05),TNF-α的mRNA表达在刺激后的4h达最高(P0.05)。以上结果说明,本实验室体外培养的奶牛乳腺上皮细胞具有表达与免疫有关的细胞因子功能,可以作为一种模型来研究奶牛乳腺炎的发病机制。     

奶牛乳腺细胞IL8基因在三种菌落刺激下的表达变化研究

[目的]研究IL8基因在不同菌落刺激下在奶牛乳腺细胞中的表达变化。[方法]本试验运用SYBR Green实时荧光定量PCR技术进行定量测定。[结果]IL8基因的mRNA水平在E.coli,Streptoc.刺激下表达差异达显示水平,而在S.aureus刺激下无明显变化。[结论]IL8基因在细胞水平上对E.coli,Streptoc.刺激较敏感,为以后进一步研究IL8基因的表达机理奠定基础。     

组织型纤溶酶原激活剂基因在牛卵丘-卵母复合体体外成熟进程中的表达

为了初步了解组织型纤溶酶原激活剂(tissue-plasminogen activator,tPA)在牛卵丘－卵母复合体体外成熟进程中的潜在作用,试验运用实时定量RT-PCR技术分别检测体外成熟过程中不同时间段(0、8、16、24 h)以及添加不同浓度FSH成熟培养16 h后的牛卵丘细胞和卵母细胞中tPA基因相对表达变化,观察添加不同浓度FSH成熟培养16 h后卵丘细胞膨胀程度差异,并统计卵母细胞第一极体排出情况。结果显示,卵丘－卵母复合体在体外成熟初期,tPA mRNA相对表达水平在体外成熟16和24 h的卵丘细胞和卵母细胞中显著高于0和8 h组;在添加不同浓度FSH (0、0.01、0.1和1 IU/mL)体外成熟16 h的各处理组,卵丘细胞中tPA mRNA相对表达量随FSH添加浓度的升高而升高,卵丘细胞的扩散程度亦随之增加;同时tPA mRNA相对表达量在0.01 IU/mL FSH添加组卵母细胞中显著高于其他各FSH添加组。综合以上研究结果,本研究认为,牛卵丘细胞中tPA基因的表达受FSH正向调节;tPA可能促进了卵丘细胞在体外成熟过程中的扩散;同时,tPA在卵母细胞中的表达是否与其第一极体排出有关,需进一步试验验证。     

绵羊甲状腺细胞原代培养及鉴定

试验旨在建立一套完整的绵羊甲状腺细胞的原代培养方法,为绵羊甲状腺功能的体外研究奠定基础。通过常规消化分离得到甲状腺滤泡上皮细胞,光镜下对不同培养时间的细胞进行形态学观察,并结合RT-PCR、细胞免疫荧光和ELISA,对培养的绵羊甲状腺细胞从形态,甲状腺球蛋白(TG)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、促甲状腺激素受体(TSHR)特异基因mRNA表达,TG特异抗原蛋白表达和甲状腺激素T3、T4的分泌功能等方面进行鉴定。结果显示,绵羊甲状腺细胞在体外呈贴壁式生长,具有上皮样细胞特点;TG染色呈胞浆阳性,具有特异TPO、TG、TSHR mRNA表达及分泌T3、T4的功能,但T3、T4的分泌量随培养时间的延长呈递减趋势。本研究成功地建立了简便可行的绵羊甲状腺细胞的原代培养方法,为深入研究绵羊甲状腺的功能提供了试验平台。     

鼠李糖乳酸杆菌LG_A对鸡小肠上皮细胞β-防御素-9基因表达的影响

本研究旨在研究益生性鼠李糖乳酸杆菌LGA对体外培养的鸡小肠上皮细胞β-防御素-9 (AvBD9)表达的调节作用.选用鼠李糖乳酸杆菌LGA对体外培养的鸡小肠上皮细胞进行剂量依赖性及时间依赖性刺激实验,利用实时荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)从mRNA水平研究刺激后上皮细胞AvBD9基因表达水平的差异.结果表明,不同浓度(2×105、2×106、2×107 cfu· mL-1)鼠李糖乳酸杆菌LGA均能上调AvBD9mRNA的表达,且在不同细菌浓度之间AvBD9 mRNA的表达存在差异.热灭活鼠李糖乳杆菌LGA亦能上调AvBD9基因表达,且上调值显著高于活菌(P＜0.05).鼠李糖乳杆菌LGA刺激上皮细胞后AvBD9表达存在时间依赖关系,12 h时AvBD9的表达达到峰值.Western blot检测结果显示,鼠李糖乳杆菌LGA刺激后的上皮细胞培养上清中存在AvBD9蛋白表达,表明AvBD9蛋白可以分泌到细胞外而发挥其生物学功能.益生性鼠李糖乳酸杆菌LGA与鸡肠道上皮细胞的相互作用过程中,鼠李糖乳酸杆菌LGA能够促进上皮细胞抗菌肽β-防御素-9的表达.本研究结果提示益生性乳杆菌可能通过促进肠道上皮抗菌肽的表达而发挥其益生作用.     

GnRH主动免疫对SD雄鼠下丘脑GnRH合成及性腺反馈系统的影响

探讨GnRH主动免疫对SD雄鼠下丘脑GnRH合成及性腺反馈系统的影响。36只SD雄鼠随机分为免疫组、手术去势组及对照组,免疫组于12周龄时初免,8周后加免。放免法测定血清抗体滴度、激素浓度及下丘脑正中隆起GnRH含量,实时荧光定量PCR分析下丘脑生殖相关基因mRNA的变化。结果显示,GnRH主动免疫后12只免疫鼠中11只血清GnRH抗体滴度显著升高,血清LH、FSH及T浓度显著降低(P<0.05),睾丸严重萎缩(免疫去势鼠)。与对照鼠相比,免疫去势显著降低下丘脑GnRH含量(P<0.01),且显著下调下丘脑雌激素α受体(ERα)、雄激素受体(AR)、Kiss-1、GPR54及GnRH的mRNA表达水平(P<0.05)。手术去势鼠除血清LH、FSH浓度及下丘脑ERα的mRAN表达水平显著高于对照鼠外(P<0.05),其余指标均与免疫去势鼠类似。结果首次表明,GnRH主动免疫抑制性腺负反馈调节作用及降低了下丘脑GnRH的合成。     

测定多种动物血清中LH生物活性RRA法的应用

利用已建立的可测定多种动物血清中促黄体激素 ( LH)生物学活性的 LH-RRA法 ,检测了不同生理状态下的 LH分泌量 ,进一步分析了该 RRA法在实践应用中的可靠性。通过用特异性刺激 LH分泌的 LRH-A3注射动物和诱导体外培养的垂体细胞分泌 LH的试验表明 ,该方法具有很高的特异性和可靠性。结果显示 ,雄兔对于 LRH-A3刺激有特异性反应。 2只兔前后、不同兔同时的对照试验表明 ,该 RRA法可以特异性地检测出 LRH-A3引起的 LH特异性变化。对母猪发情至早期妊娠阶段血清中 LH检测结果表明 ,此 RRA法可有效地测定出猪血清中 LH的动态变化。利用绵羊垂体细胞体外培养模型 ,分别用不同剂量的 LRH-A3( 0、1、1 0、1 0 0、1 0 0 0 ng/孔 )诱导垂体细胞合成和分泌 LH,RRA测定结果表明 ,试验组 LH含量分别比对照组增加 1 .77、1 .78、2 .0 3和 1 .4 6倍 ( P <0 .0 1 ) ,呈现剂量依赖关系。以上结果表明 ,建立的 LH-h CG的 RRA可以替代 RIA和体外生物测定法