鸭圆环病毒的PCR鉴定及分子特点分析

本研究采用2对针对鸭圆环病毒(DuCV)的特异性引物,对57份病死鸭病料进行PCR检测,探究了DuCV在病死鸭的感染情况;同时,随机选择2个DuCV阳性的样品进行克隆、序列测定。结果显示,病死鸭中DuCV阳性率为7.0%;同源性分析显示,2株DuCV的核苷酸序列与广西参考株(KC460535)的同源性最高,分别为97.7%、96%。基因进化树分析显示,2株DuCV与德国参考株(AY228555)和广西参考株(KC460532、KC460535)属于同一群,为基因1型。本研究对病死鸭DuCV感染情况的初步调查,补充了其流行病学资料,对肉鸭疫病防控具有一定的参考意义。     

2020—2021年山东省部分地区鸭圆环病毒全基因组遗传进化及特征分析

为了解山东地区鸭圆环病毒(DuCV)流行状况及基因组特征,对山东济宁、潍坊等地区的病鸭病料进行DuCV检测及鉴定,DuCV阳性样品进行全基因组扩增,并进行遗传进化和基因组特征分析。结果显示:成功获得了14株DuCV的全基因组序列,全长为1 993～1 995 bp,遗传进化显示这些毒株与德国株AY22855处同一进化分支,均属于DuCV基因Ⅰ型,但不同年份之间已形成独立小分支且彼此之间同源性不高;Cap和ORF3蛋白氨基酸序列分析发现,2020年与2021年监测毒株Cap蛋白氨基酸同源性为96.7%,提示病毒变异速度和程度较高,增加了防控的难度。研究为山东地区鸭圆环病毒病的防控提供了重要数据支撑。     

2019年我国部分地区鸭圆环病毒基因序列测定与分析研究

为了解近年鸭圆环病毒流行毒株的基因遗传特点和变异情况,通过采用PCR的方法对我国部分地区的30份鸭圆环病毒阳性样品进行全基因组扩增与克隆、序列测定及遗传进化分析。结果显示:30株DuCV流行毒株之间的全基因序列同源性为85.8%~99.9%,其中26株DuCV的全基因序列长为1993~1995 bp,与德国代表株处于同一进化分支,属于基因1型,4株DuCV的全基因序列仅有1988 bp,与中国台湾代表株属于同一进化分支,属于基因2型;Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列的变异分析表明Cap蛋白的变异程度要显著高于Rep蛋白。     

鸭圆环病毒ORF-C1基因的扩增及遗传进化分析

鸭圆环病毒(DuCV)感染能够引起鸭的免疫抑制，引起多种病原的继发性感染，在我国鸭群中广泛流行。为了解DuCV的遗传变异情况，对采自山东、江苏和贵州3个省份的19个鸭场的样品进行了PCR测定，并对DuCV的ORF-C1基因进行测序和遗传进化分析。PCR测定结果显示，19个鸭场中有9个鸭场的样品为DuCV阳性，总体阳性率为47.4%;ORF-C1基因序列测定结果显示，9株DuCV之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为93.4%～100%和82.2%～100%,与NCBI中已公布的DuCV毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为77.8%～99.5%和71.5%～-99.6%;遗传进化分析显示，9株DuCV全部属于DuCV-1b亚型，其中有7株在同一分支上，与D11-JW-001等韩国毒株遗传距离较近，另外2株则与山东、广西的毒株遗传距离较近；此外，与已公布的毒株相比，9株DuCV都在158位发生了氨基酸突变，由E/D变为L/P。上述结果表明，DuCV-1仍然为我国鸭群中的优势流行基因型，但病毒的基因也在不断地发生变异，应该对其进行持续监测。     

江西省部分地区鸭圆环病毒的检测与分子特点

本试验旨在了解江西部分地区鸭圆环病毒(duck circovirus, DuCV)的流行情况及其优势流行基因型。通过采集病死鸭的组织样品并提取组织DNA,利用PCR对鸭圆环病毒进行检测,并对部分阳性PCR产物进行测序,用BLAST、MEGA 10和DNAstar分析序列相似性,绘制系统进化树。结果,8个养鸭场中有5个鸭场检出鸭圆环病毒;42份组织样品中有18份为鸭圆环病毒阳性,阳性率为42.9%;PCR产物序列测定及BLAST分析显示均为鸭圆环病毒的基因片段,与GenBank上登录的相应序列相似性均在95%以上;序列进化分析表明,所测5条鸭圆环病毒序列均属于DuCV-1型,其中有3条序列属于DuCV-1a亚型,2条序列属于DuCV-1b亚型;5条所测序列的核苷酸相似性均在97%以上,且与其他DuCV-1型序列相似性均在95%以上,与DuCV-2型相应序列相似性均在80%～90%之间。结果表明,江西部分地区鸭圆环病毒的流行较为严重,且优势基因型为1型。本研究对了解江西地区鸭圆环病毒病的流行及开展该病的防控提供了一定的理论依据。     

鸭圆环病毒PCR检测方法的建立与应用

鸭圆环病毒病是由鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)引起的一种重要免疫抑制病,影响着我国养鸭业的发展。为建立针对DuCV的PCR快速检测方法,对GenBank中登录的DuCV全基因组序列进行遗传进化分析,通过对两种基因型的DuCV全基因组序列进行比对,在共同保守区筛选出1对引物,建立了可以同时检测DuCV两种基因型的PCR快速检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行评价。结果显示,该方法具有良好的敏感性,检测下限达1.0 fg;特异性良好,对其他常见鸭病毒核酸检测均为阴性;利用该方法对20份临床发病鸭样品进行检测,发现有6份呈DuCV阳性,序列分析表明均属于DuCV-1。该PCR检测方法的建立为鸭圆环病毒病的快速诊断和防控提供了重要手段。     

检测2种基因型鸭圆环病毒双重PCR方法的建立与应用

为了研究2种基因型鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)在我国鸭群中的混合感染情况,根据鸭圆环Cap蛋白基因序列设计了4条特异性引物,建立了可以同时检测2种基因型DuCV的双重PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,灵敏度高,最低可检测到1拷贝的DuCV核酸。使用建立的双重PCR方法对收集的山东省6个鸭群150只病死雏鸭的组织DNA进行检测,结果显示有50.0%(3/6)的鸭群检出DuCV-1和DuCV-2的混合感染,33.33%(2/6)的鸭群检出DuCV-2的单独感染。19只雏鸭被检出感染DuCV,其中2.67%(4/150)的雏鸭检出DuCV-1和DuCV-2的混合感染,10.0%(15/150)的雏鸭只感染DuCV-1或DuCV-2。结果表明,山东省鸭群中存在较为严重的DuCV-1和DuCV-2混合感染的现象。     

和田地区规模化鸭场鸭圆环病毒感染情况调查

为明确和田地区鸭圆环病毒(DuCV)在鸭群中的感染情况,通过双重PCR技术对2021年和田地区5个规模化养殖场共100例病、死鸭样品进行鸭圆环病毒检测。对检测出的阳性样品随机挑选4份进行基因测序,并进行序列比较及遗传进化分析。检测结果显示,20%(20/100)样品感染了鸭圆环病毒,且优势流行毒株为DuCV-1;和田流行优势毒株与源自山东的毒株关系最近;DuCV阳性样品中鸭出血病毒、呼长孤病毒感染率略高于DuCV阴性样品。     

鸭圆环病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型PCR-RFLP鉴别诊断方法的建立

鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)是近年来鸭群新发的免疫抑制病。对DuCV基因特征分析发现,DuCV存在两种基因型(基因1型和基因2型,Du CV-1和DuCV-2)。根据DuCV-1和DuCV-2复制相关蛋白基因编码区核苷酸序列特征,建立一种鉴别DuCV-1和DuCV-2的聚合酶联反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。结果表明,特异性的PCR引物可同时对DuCV-1和Du CV-2进行扩增,获得约616 nt大小的目的片段。将获得的PCR产物经KpnⅠ酶切后,可见DuCV-2的PCR产物可被切成两段,大小分别为360 nt和256nt;而DuCV-1的PCR产物经KpnⅠ酶切后大小不变,仍为616 nt。研究建立了鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)PCR-RFLP鉴别诊断的方法,可用于DuCV-1和DuCV-2感染的分子流行病学调查。     

广西鸭圆环病毒流行毒株遗传变异分析

为了解广西鸭圆环病毒(DuCV)流行毒株的遗传变异情况,进一步为研制鉴别诊断DuCV方法和制定科学防控措施奠定基础。采用PCR方法对采自广西不同地区的阳性鸭组织样品进行了全基因组扩增和测序,共获得14个完整的DuCV全基因组序列。与GenBank中登录的52个国内外DuCV毒株进行遗传进化分析及同源性比较。结果表明,当前广西同时存在基因1.1亚型、基因1.2亚型和基因2.1亚型3种不同的DuCV毒株在流行,其中基因1.1亚型和1.2亚型为优势流行毒株。     

鸭圆环病毒ORF3基因的克隆及序列分析

为了解鸭圆环病毒(DuCV)不同分离株ORF3基因变异情况及分析其同源性,本研究从临床病料中分离10株DuCV,扩增ORF3基因并测定其序列.通过与已知序列比对分析发现,DuCV ORF3基因分为两种基因型,大小分别为237 bp和297bp.ORF3基因同一基因型之间的核苷酸同源性为95.8％～100％,氨基酸同源性为88.6％～100％,而不同基因型之间的核苷酸同源性仅为87.8％～91.6％,氨基酸同源性仅为72.2％～81.0％.     

山东省樱桃谷鸭群鸭圆环病毒及其混合感染的调查

2006～2007年间,在山东省70个樱桃谷鸭群采集742只鸭样品,对鸭圆环病毒的感染与流行情况调查发现,33.29%感染了鸭圆环病毒;3、4周龄的鸭较2周龄更易感;与DuCV阴性鸭比较,DuCV阳性鸭与鸭I型肝炎、鸭疫里默氏杆菌及大肠杆菌的混合感染率较高.有关樱桃谷鸭感染鸭圆环病毒的流行病学调查在国际上为首次报道.     

鸭圆环病毒感染的检测

为明确鸭圆环病毒(DuCV)在鸭群中的感染情况,本研究通过PCR方法对2006～2009年间福建、浙江、江西、广东、山东等五省602例病、死鸭样品进行鸭圆环病毒检测.结果显示,15.28%(92/602)样品感染了鸭圆环病毒;40～60日龄的中鸭感染率明显高于其它日龄段;DuCV阳性样品中鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、鸭肝炎病毒1型和呼肠孤病毒感染率略高于DuCV阴性样品.     

猪圆环病毒2型吉林分离株的全基因组序列分析

采用PCR扩增1株吉林新分离的PCV2-2017全基因组序列,经过测序拼接后进行了序列分析。毒株PCV2-2017基因全长1 767 bp,在GenBank上进行同源性比对,同源性在96%～99%之间;与法国株AF055394同源性可达99%,与美国株AF055391、四川株HM102350同源性最低,为96%。PCV2中ORF1编码Rep蛋白,核苷酸和氨基酸同源性达到99%,ORF1突变很小,相对保守;ORF2基因全长为702 bp,编码Cap蛋白,氨基酸同源性达94%～99%,核苷酸同源性与美国株比对,可达96%,与法国株和国内部分毒株同源性达99%,是变异主要发生部位,共有12处点突变;ORF3编码蛋白,核苷酸同源性高达100%,说明变异不大。基因的遗传进化分析表明,PCV2-2017吉林新分离株全基因组与法国株AF055394亲缘关系最近,同属于PCV-2b亚型;与AY322001、AB426905和国内GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393毒株亲缘关系较远。     

猪圆环病毒2型山西株全基因组序列分析

为了解山西省猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异情况,本试验采用PCR方法对山西省分离的4株猪圆环病毒流行株（SXXZ1株、SXXZ2株、SXTY株和SXJZ株）的全基因组进行了扩增、克隆和测序,并将其全基因组序列与国内外34株主要流行毒株进行核苷酸同源性与系统进化树分析。结果显示,4株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJZ株为1 768 bp,其余均为1 767 bp,分别占25%和75%。4株毒株核苷酸同源性为95.9%~100.0%,与国内外34株参考株同源性为94.5%~99.9%,与国产疫苗株同源性为95.6%~99.8%;PCV2全基因组序列进化分析表明,本研究分离的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株属于PCV-2b基因型,SXJZ株属于PCV-2e基因型,其中SXXZ1株和SXXZ2株与广东QY株的进化关系最近,SXTY与奥地利AUT5株的进化关系最近,SXJZ与福建FJ株的进化关系最近;而SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株与山西PCV2疫苗DBN-SX07-2株的进化关系较近,SXJZ株与国内PCV2疫苗LG株的进化关系较近。从而证实在山西省流行的PCV2毒株以PCV-2b为主,同时还分离出了PCV-2e亚型,表明山西省存在PCV-2e亚型毒株。本试验结果为山西省PCV2的分子流行病学、遗传变异及防控奠定了基础。     

广西北部湾地区猪圆环病毒2型检测及其ORF2遗传变异分析

为了解猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)在广西北部湾地区的流行情况和其ORF2基因的遗传变异规律,本研究采用PCR方法对2016年采自广西北部湾地区规模猪场和农村散养户的306份疑似PCV2感染猪的血液和组织样品进行了PCV2的病原学检测,同时对分离的4株PCV2 ORF2基因进行PCR扩增、克隆和测序,并与Gen Bank中登录的34株国内外PCV2参考株ORF2序列进行比对和遗传进化分析。结果表明:PCV2检测阳性样品为129份,阳性率为42.16%。随机选取的4份阳性病料PCV2 ORF2基因测序结果显示,4个毒株遗传关系上均属于Group 1(PCV2b),其中BBW-1和BBW-2分离株属于1A分支且分别与Fd3株(AY321984)和NL_PMWS_3株(AY484415)同源性较高,BBW-3和BBW-4分离株属于1B分支且BBW-4分离株与Hu Zhou0301株(AY536756)和NL_Control_1株(AY484407)同源性较高,其ORF2基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%~99.5%和93.9%~95.4%,说明该地区PCV2的优势基因型是PCV2b。研究结果不仅有利于掌握广西北部湾地区PCV2流行毒株同源性情况,而且将为该地区(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的防治和新型疫苗的研制提供依据。     

3株猪Ⅱ型圆环病毒的分离及基因组序列分析

为了解混合感染中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2009年与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的病料中分离的3株PCV2通过PCR、免疫荧光等进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar对序列进行拼接和分析。结果表明:分离得到的HUN-09株(GQ449670)、HUB-09株(GQ449671)和SD-09株(GQ449669)3个PCV2毒株其全基因组长度均为1768bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为95%～99.7%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为97.6%～98.5%,与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69%～70%。进化分析表明,本研究2009年分离的3株PCV2属于基因型PCV-2a。     

猪圆环病毒2b亚型的分离鉴定及基因组序列分析

为分离鉴定流行于重庆某猪场的猪圆环病毒2型,本研究从断奶仔猪多系统衰竭综合征猪的淋巴结病料中进行病毒学检测,病毒利用PK-15细胞增殖,其基因组序列经克隆、测序、拼接获得,并完成对全序列的生物信息学分析鉴定。结果获得了1株猪圆环病毒2型(命名PCV-2CQ1),该毒株的全序列大小为1 767bp,同源性分析发现该病毒与国内公布的PCV-2毒株同源性超过了90%,尤其与广西分离株同源性达100%;系统进化分析本分离病毒与浙江株(EU257511)、黑龙江株(HM038032)聚类到一起,形成一个进化分支,同属于PCV-2b型;对编码的衣壳蛋白分析发现,PCV-2CQ1Cap氨基酸发生了较大变异,与强毒株同源性较高,考虑到本病毒源自PMWS病猪,推测该毒株属于强毒株。     

鸭腺病毒A型Hexon基因克隆与序列分析

为明确鸭腺病毒A型Hexon基因特征及其在腺病毒科病毒分类中的作用,本研究从前期分离鉴定的一株番鸭源鸭腺病毒A型分离株（JX2016株）中分段扩增获得其Hexon基因编码区。结果发现,鸭腺病毒A型JX2016株Hexon基因编码区为2 733 bp,编码910个氨基酸,与鸭腺病毒A型（FJ12025株）核苷酸同源性最高,达99.8%;与其他分离株Hexon基因核苷酸同源性均在99.4%以上;与鸭腺病毒2型（GR株,未明确分类地位）同源性仅为54.5%;与禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）及P29株（鹅源）的核苷酸同源性分别为53.6%和55.2%。遗传进化树分析发现,所有鸭腺病毒A型分离株在遗传进化上均处于相同的亚分支,且与绵羊腺病毒D型（OAV287株）均处于富AT腺病毒属遗传进化分支。但鸭腺病毒2型（GR株）与禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）、P29株（鹅源）却处于同一遗传进化分支,均属于禽腺病毒属遗传进化分支。基于Hexon蛋白的遗传进化分析,建议将鸭腺病毒A型重新命名为鸭源富AT腺病毒A型,将鸭腺病毒2型重新命名为鸭源禽腺病毒。     

鸭圆环病毒基因组序列分析及其C1截短基因的原核表达

本试验参照GenBank登录的鸭圆环病毒(DuCV)基因组序列,设计2对DuCV特异性引物,运用PCR方法从病死番鸭法氏囊中分段扩增出DuCV LJ07株基因组,将扩增片段分别克隆获得重组质粒,测序后得到全长为1 995nt的DuCV LJ07株全基因组序列,与GenBank登录的DuCV基因组序列的同源性迭83.6%～96.5%.经基因结构分析发现,DuCV LJ07株的基因组有6个开放阅读框(ORF),其中V1、C1是2个最主要的ORF,分别编码Rep蛋白和Cap蛋白;在V1和C1的5'起始端之间有与启动滚环复制有关的一茎环结构和2个正向重复序列.本试验同时还构建了去除核定位信号的C1截短基因的原核表达载体,诱导表达后经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明C1截短基因已成功地在大肠杆菌中表达出Cap截短蛋白,为建立DuCV抗体血清学检测方法和开展DuCV感染的血清学调查奠定了基础.