水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定

噬菌蛭弧菌为一类杆形、弧形或螺旋形的革兰阴性菌,可以寄生并裂解其他细菌。本试验以禽源大肠杆菌、沙门菌以及环境水体中分离的1株大肠杆菌为宿主菌,采用双层琼脂培养法成功地从环境水体中分离到3株噬菌蛭弧菌,分别命名为BDD、BDE、BDH。电镜观察证明菌体大小约0.33μm×0.78μm,单个弧形,一端有一根长鞭毛。基因序列分析表明,分离株与已发表的噬菌蛭弧菌属其他菌株16S rRNA基因序列的同源范围分别为96.0%~99.9%。通过对不同细菌的裂解试验证明,3个分离株对大肠杆菌、沙门菌、摩根摩根氏菌、变形杆菌和阴沟肠杆菌等均具有裂解作用,但对铜绿假单胞菌、鸭疫里默氏菌和金黄色葡萄球菌不敏感。     

新型鹅星状病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

新型鹅星状病毒（goose astrovirus, GoAstV）感染引起的鹅痛风病,是近年严重危害我国养鹅业的传染病之一,给我国养鹅产业造成严重经济损失,快速准确诊断有助于更好地防控该病。为了建立一种鉴定新型GoAstV的一步法RT-PCR方法,根据新型GoAstV ORF2基因序列设计特异性引物,构建质粒标准品,并对引物用量和退火温度等反应体系和条件进行了优化。结果表明,该方法能特异性扩增新型GoAstV 512 bp基因片段,其他鹅常见病毒性病原扩增结果均为阴性,具有较高的特异性。敏感性试验结果提示,最小检测限量达4.54×10²拷贝/μL。此外,该方法重复性良好,应用所建立的方法对新型GoAstV临床样品进行检测,102份鹅泄殖腔拭子的阳性率为46.08%,24份痛风症状患病鹅内脏样本阳性率为91.70%。本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且操作简便、经济、快速,可用于新型GoAstV的临床鉴别诊断和流行病学调查。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1蛋白原核表达载体的构建及表达

为对H9N2亚型禽流感病毒(AIVs)NS1基因进行原核表达,并对表达产物进行抗原性分析,根据NS1基因合成1对特异性引物,进行PCR扩增,将扩增片段连接至PMD18-T载体,通过序列测定和比对筛选出保真基因克隆;将保真基因克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a-NS1后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,加入IPTG进行诱导表达;并对IPTG使用浓度和诱导时间进行优化,对表达的重组蛋白用His-tag镍柱进行纯化,利用Western Blot和免疫荧光技术对纯化的重组蛋白进行鉴定及免疫原性的测定。结果显示,本试验成功扩增出H9N2 AIVs的NS1基因,并筛选到保真克隆;带有NS1保真基因的重组载体pET32a-NS1可在大肠杆菌中进行IPTG诱导表达,其中,IPTG最佳使用浓度为2 mmol/L、最佳诱导时间为8 h时表达量最大,并且表达产物主要存在于包涵体中;纯化后的重组蛋白可被抗His标签识别,利用重组蛋白制备的抗体可识别H9N2 AIVs在细胞内表达的NS1蛋白,说明重组蛋白具有良好的免疫原性,该试验为H9N2 AIVs NS1蛋白的功能特性和免疫学研究奠定了基...     

鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定

[目的]拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础.[方法]取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用.[结果]DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70).含重组质粒pET32a-HSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应.以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染.[结论]HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计.     

坦布苏病毒感染诱导雏鸭体内未折叠蛋白反应

【目的】检测坦布苏病毒在雏鸭体内诱导未折叠蛋白反应的信号通路（PERK、IRE1和ATF6）,为揭示坦布苏病毒致病机制提供理论基础。【方法】取1日龄SPF雏鸭,腹腔接种坦布苏病毒（JS804株）,于接种后12、24、36和48 h从对照组和攻毒组各取5只剖杀,分别取肝脏、心脏和脑组织,利用组织总RNA提取试剂盒提取各个组织样品总RNA,反转录获得cDNA。根据未折叠蛋白反应的3条信号通路,选取不同通路中的标志性分子,设计合成特异性引物,利用荧光定量PCR方法检测靶基因。以GAPDH为内参基因,采用相对定量法（2^-ΔΔCt）,分析靶基因的表达水平。【结果】雏鸭肝脏中坦布苏病毒含量最高,心脏次之,脑最低。对未折叠蛋白反应标志性分子GRP78的检测结果显示,脑和肝脏中GRP78表达量持续升高,并在攻毒后36 h达到顶峰（4.21倍和10.14倍）,心脏中GRP78表达量仅在攻毒后36 h短暂升高（1.32倍）。PERK信号通路标志性分子ATF4表达水平在肝脏和脑中分别从攻毒后24 h和36 h持续升高至攻毒后48 h,并在攻毒后36 h达到顶峰（2.71倍和6.02倍）,心脏中ATF4的表达量则仅在攻毒后36 h时升高（1.57倍）。IRE1信号通路标志性分子XBP1s在肝脏中的表达量升高最为显著（9倍）,而脑中EDEM的表达量升高最为显著（3.87倍）且持续时间最长（从攻毒后12 h至攻毒后48 h）。与对照组相比,ATF6信号通路标志性分子GRP94和XBP1u均出现升高现象,虽然两种蛋白在不同组织中表达量变化的时间点和趋势不同,但均在攻毒后36 h出现峰值。【结论】首次报道了坦布苏病毒感染可在雏鸭体内激活未折叠蛋白反应的3条信号通路,本研究将有助于深入研究坦布苏病毒与宿主之间的相互作用机制。     

H9N2亚型禽流感病毒HA检测片段阳性质粒的构建

本试验按照农业部NYT 772─2013标准构建了长度为487 bp的H9N2亚型禽流感病毒HA检测片段阳性质粒,并对该阳性质粒的特异性、敏感性和重复性进行了鉴定,获得了可用于检测H9N2亚型禽流感病毒HA片段的阳性质粒。该质粒在-20℃下即可保存,使用方便,不会污染环境,不存在散播病毒的危险。     

坦布苏病毒感染DF-1细胞入侵途径的初步研究

坦布苏病毒是我国新发易引起家禽出现严重产蛋下降和中枢神经系统异常的重要传染病病原.通过特异性的化学阻断剂预处理DF-1细胞,噬斑计数法检测其对病毒滴度的影响,相对荧光定量RT-PCR检测其对病毒核酸表达的影响,并对影响显著的结果进行吸附和内吞试验.结果显示,网格蛋白抑制剂氯丙嗪和动力蛋白抑制剂dynasore可显著降低病毒滴度和病毒核酸表达,且主要作用于内吞过程,对病毒吸附无影响.胆固醇抽提剂甲基-β-环糊精、小窝蛋白抑制剂genistein及胞吞抑制剂EIPA对病毒滴度无明显影响.结果表明,坦布苏病毒入侵DF-1细胞依赖于网格蛋白和动力蛋白,而不依赖于胆固醇、小窝蛋白和胞吞作用.     

小鼠转录因子STAT1真核表达质粒的构建及生物学功能分析

本研究以小鼠组织的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到小鼠信号转导子和转录激活子1(STAT1)基因完整开放阅读框的碱基序列,然后将其克隆到真核表达载体p DsRed-N1中,构建p DsRed-N1-STAT1重组质粒。测序成功的真核质粒转染至BHK-21细胞,通过α干扰素(IFN-α)分子刺激,检测细胞中STAT1分子的活化状态与定位,最终通过坦布苏病毒刺激,荧光显微镜检测STAT1分子的细胞内定位。结果表明,小鼠的STAT1基因开放阅读框为2 250 bp,编码749个氨基酸。同源性比对结果表明,小鼠STAT1与人、大鼠、猪、马等哺乳动物STAT1氨基酸序列的一致性分别为92%、97%、91%、91%。转染结果表明,构建的p DsRed-N1-STAT1真核表达质粒在BHK-21细胞中成功表达,无IFN-α刺激时,红色荧光只在BHK-21细胞的细胞质中出现,而加入IFN-α后,红色荧光则大多分布于细胞核内。用坦布苏病毒感染细胞后,红色荧光多分布于细胞质中。说明,构建的真核质粒p DsRed-N1-STAT1在哺乳动物细胞中能够正确表达融合蛋白质Red-STAT1,而且在IFN-α刺激下,Red-STAT1可由细胞质向细胞核转运,同时发现,坦布苏病毒感染能够有效抑制STAT1分子的核转运。     

猪轮状病毒的分离与电镜观察

近年来,北京地区猪轮状病毒感染,不仅严重威胁养殖业的发展,同时威胁到肉食品和人类的安全。取胶体金抗原检测为阳性的2头哺乳仔猪病料用Marc-145细胞培养,分离到1株轮状病毒,连续盲传至4代出现细胞病变,用Marc-145细胞进行病毒噬斑纯化,挑取单克隆病毒株扩大培养后,将病毒感染Marc-145细胞7 d后,应用Reed-Muench法计算轮状病毒TCID50为106.6/0.1 mL,用感染细胞超薄切片进行电镜观察,可见典型的晶格状排列的轮状病毒粒子,为轮状病毒感染的诊断提供了科学依据。