丙酸钠和丙酮酸钠对体外培养牛肝细胞内丙酮酸羟化酶基因mRNA水平的影响

在成功构建牛肝细胞培养模型和PC基因DNA竞争模板的基础上，采用竞争RT—PCR方法检测了丙酸钠和丙酮酸钠对体外培养新生牛单层肝细胞PC基因mRNA丰度的影响。结果，随着丙酸钠浓度的升高，PC基因mRNA水平呈上升趋势，PC基因mRNA对丙酸钠的耐受范围较广；随着丙酮酸钠浓度的升高PC基因mRNA水平呈先上升后下降的趋势。结果表明，肝细胞内PC基因mRNA的表达水平受丙酮酸钠浓度的调控，在一定范围内丙酮酸钠对PC基因mRNA的转录具有促进作用，而浓度过高时则起抑制作用。     

竞争定量RT-PCR检测不同能量摄入对围产期奶牛肝PCmRNA丰度的影响

建立了奶牛肝PCmRNA丰度的竞争定量RT-PCR检测方法,优化的PCR反应条件(25μL)为:60℃退火、30个循环数、1:1的PC cDNA与PC DNA竞争模板浓度比。同时应用该方法检测不同能量摄入对围产期奶牛肝PCmRNA丰度的影响,结果表明:低能量日粮饲喂干奶期奶牛,肝脏PC mRNA丰度升高,而干奶期高能饲喂奶牛,肝脏PC mRNA丰度降低。说明干奶期低能饲喂奶牛,可以增强围产期奶牛的肝糖异生能力。     

竞争性RT-PCR检测铜对Ctr1 mRNA表达的影响

为了应用竞争 RT- PCR法检测铜对猪传代肾细胞 (PK15 )中特异性铜转运蛋白 Ctr1基因 m RNA表达水平的影响 ,经 2次克隆 ,将筛选出一段 4 0 0 bp的核苷酸序列 ,插入 RT- PCR扩增出的 5 30 bp Ctr1目的片段中 ,构建了插入突变型 Ctr1- c DNA竞争模板。再将竞争模板与各试验组 c DNA同时进行 PCR扩增。结果 ,猪肾 PK15细胞 Ctr1基因m RNA表达量在 7.8～ 31.2 μmol/ L Cu范围内随铜添加浓度的升高减少 ,当铜添加浓度达到 6 2 .5 μmol/ L 时 ,其表达量又有所回升 ,呈双相反应。     

生糖底物和神经内分泌因子对新生犊牛肝细胞PEPCK-C mRNA表达水平的影响

在原代单层培养的新生犊牛肝细胞培养液中分别加入不同浓度丙酸钠、丙酮酸钠、胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白，培养12h后，应用半定量RT-PCR方法检测体外培养的肝细胞PEPCK—C mRNA的丰度。结果显示，随着丙酸钠、丙酮酸钠浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度均先升高后下降（P〈0．01）；随胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度分别剂量依赖性地降低、升高（P〈0．01）和无显著变化。表明，丙酸钠、丙酮酸钠能通过上调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而促进肝糖异生代谢，但上调作用是有限的；胰岛素能通过下调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而抑制肝糖异生代谢，且下调作用呈剂量依赖性；胰高血糖素与胰岛素作用刚好相反；瘦蛋白未起直接的调节作用。     

猪Viperin基因丙酸诱导型载体构建及表达

本试验以猪十二指肠cDNA为模板,通过PCR、酶切鉴定克隆Viperin基因,利用非酶连接技术将其连接丙酸诱导型表达载体pEX5,经丙酸钠诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting进行表达蛋白鉴定。结果显示,成功克隆了猪Viperin基因,包括完整开放阅读框ORF,其长度为1 046bp,将扩增得到的序列成功连接到载体pEX5,构建了pEX5-Viperin;SDS-PAGE和Western-blotting。6×His-NusA-TEV-LIC-Viperin融合蛋白主要以包涵体形式表达,其相对分子质量约96 500。结果表明,pEX5-Viperin的成功构建,为后续猪Viperin蛋白的纯化,Viperin基因与病毒互作关系及信号通路调控机制的研究奠定了基础。     

体外批次培养法研究棉籽对培养液参数的影响

在体外批次培养试验中，在培养底物中添加棉籽使脂肪含量达4％～8％时有增加培养液中乙酸、丙酸、丁酸及总挥发性脂肪酸浓度的趋势，但与对照组间差异不显著（P〉0．05），使乙：丙比值显著降低（P〈0．05）；有降低纤毛虫数量的趋势，其中8％脂肪组的纤毛虫数量显著降低（P〈0．05）；对培养液中pH值和NH3-N的影响无明显规律。     

λgtl0 cDNA文库表达序列标签测定时模板处理方式

表达序列标签是揭示基因组容量的有效方法。在构建cDNA文库的基础上，对以λgtl0为载体进行表达序列标签到定时模板的处理方法进行了探讨。结果表明，以λ噬菌体DNA为模板直接测序比PCR产物经回收后为模板进行测序，其目标克隆的平均插入片段长度要长，但反应成功率低。以λ噬菌体浸提液为模板进行PCR并在产物回收后进行测序反应，可能是以λ噬菌体为载体构建文库的表达序列标签测定的最佳选择。     

采用定量竞争PCR技术定量分析猪DNA

当今的许多肉产品都可能由几种动物的肉按照不同比例组成。为保证消费者不受欺骗，有必要对复合食物产品的成分同时进行定性和定量监测，多聚链式聚合反应（PCR）等以DNA为基础的技术被广泛应用于种类鉴定，但利用当前的技术不能测出某种特定成分的比例，本研究报道了一种用于猪DNA检测和定量分析的定量竞争多聚链式聚合反应技术（QC－PCR的开发和评定，该技术采用一种以生长激素基因sus scrofa为基础的新型猪特异性PCR系统，构建一个与猪的目标序列在长度上仅差30bp的DNA竞争物，与目标序列一起用于PCR。用来自牛、羊、肉鸡和火鸡的DNA对这个新引物的特异性进行了评价，通过含有猪DNA和相应数量牛DNA的混合物的共同扩增使竞争物的浓度调到猪DNA含量的2％或20％。     

体外批次培养法研究胡麻籽对培养液参数的影响

在体外批次培养试验中,在培养底物中添加胡麻籽使脂肪含量达4%～8%时有增加培养液中乙酸、丙酸、丁酸及总VFA(挥发性脂肪酸)浓度的趋势,但与对照组间差异不显著(P>0.05),使乙酸与丙酸比值显著降低(P<0.05);有降低纤毛虫数量的趋势;对培养液中pH值和氨氮(NH3-N)浓度的影响无明显规律。     

体外产气法研究牛至油对绵羊瘤胃发酵特性和甲烷产量的影响

本试验采用体外产气法研究在体外培养液中添加牛至油对绵羊瘤胃发酵特性和甲烷产量的影响。采用单因素完全随机试验设计,在培养液中分别添加0(对照)、100、200、300和400 mg/L牛至油,每组5个重复。发酵12 h后,测定总产气量、甲烷产量及培养液p H,总氮、氨氮、尿素氮、蛋白氮浓度及挥发性脂肪酸浓度和比例。结果表明:1)培养液中添加100、200、300和400 mg/L牛至油均显著升高了培养液p H(P0.05);高添加水平(300、400 mg/L)的牛至油显著降低了培养液总挥发性脂肪酸浓度和丙酸比例(P0.05),显著升高了培养液乙酸比例和乙酸/丙酸(P0.05),抑制了瘤胃发酵。2)与对照组相比,除100 mg/L牛至油组外,其余各试验组培养液氨氮浓度均显著降低(P0.05)。3)高添加水平(300、400 mg/L)的牛至油在显著降低甲烷产量的同时也显著降低了总产气量(P0.05)。由此可知,牛至油能调控瘤胃发酵和降低甲烷产量,但过高添加水平对绵羊瘤胃发酵有抑制作用,体外条件下最适添加水平为200 mg/L。     

氮源和水平对肉牛体外瘤胃发酵特性的影响

为研究氮源和水平对肉牛瘤胃发酵特性的影响,本试验利用体外培养法研究不同水平(0、50、100和200 mg/L)的尿素、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸对培养液pH、氨态氮、微生物蛋白质、挥发性脂肪酸的影响.结果表明:在体外培养条件下,以亮氨酸和异亮氨酸为氮源,培养液pH和微生物蛋白质浓度分别显著低于和显著高于以尿素为氮源(P＜0.05),以支链氨基酸为氮源培养液氨态氮浓度显著低于以尿素为氮源(P＜0.05),以异亮氨酸为氮源培养液总挥发性脂肪酸、乙酸和丙酸浓度都显著高于其他氮源(P＜0.05);随着氮水平的提高,培养液pH以及氨态氮、微生物蛋白质和丙酸的浓度都显著的升高(P＜0.05);氮源和水平对各指标均存在显著的互作效应(P＜0.05).结果提示,亮氨酸作为氮源更有利于微生物蛋白质的合成;200 mg/L的氮水平有利于瘤胃微生物的发酵;氮源和水平对瘤胃发酵存在互作效应.     

酵母培养物对山羊瘤胃纤维素酶活及挥发性脂肪酸的影响

在高精料日粮条件下,以4头装有永久性瘤胃瘘管的本地山羊为试验动物,采用4×4拉丁方设计,研究酵母培养物(0、20、30、和40g/d)对山羊瘤胃纤维素酶活及挥发性脂肪酸(VFA)的影响。结果表明:日粮中添加酵母培养物有提高瘤胃中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)消失率及羧甲基纤维素酶活、木聚糖酶活的趋势,但差异均不显著(P>0.05)。日粮中添加酵母培养物能够提高瘤胃乙酸、丙酸、丁酸、TVFA浓度及乙酸丙酸比。与对照组相比,早饲后4h时,20g/d处理组乙酸浓度提高22%(P<0.05),TVFA浓度提高21%(P<0.05),30g/d处理组的丙酸浓度提高11%(P>0.05);18h时,30g/d处理组乙酸浓度和TVFA浓度较对照组分别提高32%(P<0.05)和28%(P<0.05)。     

体外研究反刍兽新月形单胞菌及与酵母联用对瘤胃微生物发酵的影响

利用体外批次培养技术,分别以羊草、玉米和淀粉为底物,研究了反刍兽新月形单胞菌L9菌株及其与酵母联用对瘤胃微生物发酵的影响。结果显示,以羊草为底物时,添加酵母可显著提高乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度(P<0.05),有降低乙丙比值的趋势(P=0.082),但对异丁酸及pH值无显著影响(P>0.10),添加L9菌可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度和乙丙比值(P<0.05),但对异丁酸及戊酸浓度无显著影响(P>0.10),在影响pH值、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、TVFA浓度及乙丙比值方面,酵母与L9菌株间无显著的互作关系(P>0.10);在降低乳酸及戊酸浓度方面,酵母与L9菌株之间有显著的互作作用(P<0.05),在影响pH值及乙酸产量方面,酵母与L9菌之间有互作效应趋势。以玉米为底物时,添加酵母可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度和乙丙比值(P<0.05),有提高戊酸浓度的趋势(P=0.082),但对异丁酸无显著影响(P>0.10),添加L9菌可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度和乙丙比值(P<0.05),但对异丁酸浓度无显著影响(P>0.10),在影响pH值、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、TVFA浓度及乙丙比值方面,酵母与L9菌株间有显著的互作关系(P<0.05);在影响异丁酸及戊酸浓度方面,酵母与L9菌株之间无显著的互作作用(P>0.10)。以淀粉为底物时,添加酵母可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度(P<0.05),但对戊酸、异丁酸浓度和乙丙比值无显著影响(P>0.10),添加L9菌可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度和乙丙比值(P<0.05),但对异丁酸和异戊酸浓度无显著影响(P>0.10),在影响pH值、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、TVFA浓度及乙丙比值方面,酵母与L9菌株间有显著的互作关系(P<0.05);在影响异丁酸及戊酸浓度方面,酵母与L9菌株之间无显著的互作作用(P>0.10)。结果说明,添加酵母与L9菌株均可有效降低乳酸产量,且均可有效提高玉米及淀粉条件下发酵体系中的pH值,酵母与L9菌株联用更有助于发酵前期pH值的稳定。     

体外法研究不同硒源及硒水平对瘤胃挥发性脂肪酸的影响

试验旨在利用体外厌氧发酵培养技术研究不同硒源及不同硒水平的添加对奶牛瘤胃挥发性脂肪酸(VFA)含量的影响。试验按照3×4完全随机试验设计,第一因素为硒源,即亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和酵母硒3种,第二因素为硒添加量,即每毫升培养液中设0μg、0.1μg、0.2μg和0.3μg共4个添加水平,其中0μg/mL添加水平为对照组,共计10个处理组,每个处理组均进行3h、6h、9h、12h、24h和48h的体外批次培养,每个处理组设3个重复。试验结果表明,体外培养液中添加3种不同来源的硒对乙酸、丁酸、TVFA的影响组间差异显著(P<0.05),对丙酸、乙酸丙酸比影响较小(P>0.05),其中以添加酵母硒的乙酸、丙酸、丁酸、TVFA的效果最好,添加硒代蛋氨酸次之;体外培养液中添加0.3μg/mL硒,可显著提高乙酸、丁酸、TVFA的含量(P<0.05),对丙酸及乙酸丙酸比影响组间差异不显著,但均以0.3μg/mL硒组的效果较好。     

酵母菌培养物对瘤胃发酵的影响

本研究采用完全随机试验设计,使用持续动态人工瘤胃装置,研究了酿酒酵母菌培养物对瘤胃发酵的影响。试验处理为对照组、1%和5%(占发酵液体积)酿酒酵母菌培养物添加组。通过对瘤胃液pH、微生物蛋白质(MCP)、氨态氮(NH3-N)、挥发性脂肪酸(VFA)浓度的测定得出以下结果:添加酿酒酵母菌培养物对pH和NH3-N浓度没有显著影响(P>0.05);5%酿酒酵母菌培养物添加组显著提高MCP浓度并降低了丙酸浓度(P<0.05);而酿酒酵母菌培养物对总挥发酸酸、乙酸、丁酸和乙、丙酸比例没有显著影响(P>0.05)。以上结果表明:添加一定量的酿酒酵母菌培养物可在不改变瘤胃发酵类型的情况下,促进微生物蛋白质的合成。     

In vitro effects of the ionophore lysocellin on ruminal fermentation and microbial populations.

Batch and continuous culture techniques were used to evaluate the effect of the ionophore lysocellin on ruminal fermentation and microbial populations. In batch culture, .5 and 1 ppm (of the fluid) lysocellin markedly decreased (P less than .01) the acetate:propionate ratio without affecting fiber digestion, ammonia concentration, or culture pH. Greater concentrations of lysocellin had negative effects (P less than .05) on fiber digestion and increased (P less than .05) culture pH. In continuous culture, a low level of lysocellin (33 ppm of the diet DM or about .7 ppm of the fluid) decreased pH (P less than .05) and methane (P less than .05) production but had no effect on fiber digestion. Lysocellin tended to increase (P less than .05) OM digestion in corn-based diets but decreased OM digestion in barley-based diets (starch source x lysocellin interaction, P less than .05). In addition, the molar proportion of propionate was increased more in barley- than in corn-based diets. Total anaerobes and amylolytic and lactate-utilizing microorganisms were not affected by the ionophore. In continuous culture, cellulolytic and lactate-producing organisms were insensitive to lysocellin, but, in lysocellin-treated media, cellulolytic organisms were resistant, whereas lactic acid producers were sensitive to lysocellin at 4 ppm. In summary, the ionophore lysocellin alters ruminal fermentation by decreasing ruminal methane production and increasing the molar proportion of propionate; however, effects varied depending on whether corn or barley served as the primary starch source.     

高精料条件下酵母培养物对混合瘤胃微生物体外发酵的影响

采用山羊瘤胃液的体外批次培养研究了酵母培养物对混合瘤胃微生物体外发酵的影响。发酵底物精粗比为7:3,酵母培养物添加量为0、0.75 g/L1、.5 g/L2、.25 g/L。结果表明,发酵各时间点,各处理组的pH值较对照组均显著降低(P<0.05)。与对照组相比,发酵24 h、36 h4、8 h时,各处理组氨氮浓度显著降低(P<0.05),2.25 g/L处理组的TVFA浓度显著升高(P<0.05)。各时间点,三个处理组的乙酸浓度与对照组相比差异均不显著,而发酵24 h4、8 h时,三个处理组的丙酸浓度均高于对照组(P<0.05)。发酵24 h、48 h时,1.50 g/L处理组的乙丙比较对照组显著降低(P<0.05)。在整个发酵期内,1.50 g/L、2.25 g/L处理组的累积产气量均显著高于对照组(P<0.05),各组干物质消失率无显著差异(P>0.05)。结果显示,酵母培养物能够显著提高瘤胃VFA浓度,降低乙酸/丙酸比例,改变瘤胃发酵类型。     

Effect of a Saccharomyces cerevisiae culture on lactate utilization by the ruminal bacterium Selenomonas ruminantium.

The objective of this study was to examine the effects of a Saccharomyces cerevisiae culture (YEA-SACC) on lactate utilization by the predominant ruminal bacterium Selenomonas ruminantium. Lactate uptake was stimulated by YEA-SACC concentrations between 2.5 and 10 g/liter, and the 5-g/liter level increased uptake 3.8-fold. When YEA-SACC concentrations were increased above the 5-g/liter level lactate uptake was decreased, but 10 g/liter still stimulated uptake more than threefold. A filter-sterilized YEA-SACC filtrate also increased lactate uptake more than fourfold at all concentrations tested (10 to 100 microliters/ml), and the 25-microliters/ml level increased uptake ninefold. Growth of S. ruminantium in medium that contained 2 g/liter of DL-lactate was stimulated more than twofold by either 2 or 5% (vol/vol) YEA-SACC filtrate after 24 h. The YEA-SACC filtrate also increased the production of acetate, propionate, total VFA, and YLACTATE (grams of cells/mole of lactate) from lactate-grown cells. Because the increase in propionate production was greater relative to acetate, a decrease in the acetate:propionate ratio was observed. Growth on lactate and uptake of radiolabeled lactate by S. ruminantium was stimulated by a filter-sterilized YEA-SACC filtrate. The concentration of L-malic acid in the YEA-SACC filtrate was 4.9 mM, and it seemed that L-malic acid played a role in the stimulation of growth on lactate as well as lactate uptake by S. ruminantium treated with YEA-SACC.     

用体外产气法评价精粗饲料的组合效应

以3头安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为供体动物,利用体外产气法,通过产气量、干物质(DM)、有机物(OM)和中性洗涤纤维(NDF)的降解率、挥发性脂肪酸(VFA)产量这五个指标的测定,评价精粗比(玉米:稻草)为0∶100、20∶80、30∶70、50∶50、100∶0的五种饲料组合的营养价值及组合效应。结果表明,随着体外培养时间的延长,各精粗比日粮体外累积产气量及DM、OM、NDF降解率、TVFA产量均呈上升趋势;随着精料水平的提高,累积产气量不断升高,DM和OM的降解率均呈上升趋势,NDF降解率下降,乙酸含量减少,丙酸含量增加。精粗比为30:70的混合日粮多项组合效应值最高,组合效应最好。