黄芪解毒汤诱导乳腺癌细胞凋亡及对β-catenin、C-myc基因表达影响的研究

目的 探讨黄芪解毒汤体外干预人乳腺癌细胞MCF-7凋亡及对β-catenin、C-myc基因表达的影响,及该方抑制乳腺癌复发转移的可能机制。方法 培养MCF-7细胞并将其分为黄芪解毒汤组、阿霉素组及空白对照组。以黄芪解毒汤浓缩液、阿霉素液及细胞培养液分别干预各组MCF-7细胞24h后,以流式细胞仪检测其对MCF-7乳腺癌细胞凋亡的影响,实时荧光定量PCR检测其对β-catenin, C-myc基因表达的影响。结果 与空白对照组比较,黄芪解毒汤组、阿霉素组可明显诱导MCF-7细胞的凋亡（P<0.01）;黄芪解毒汤组及阿霉素组β-catenin、C-myc表达量明显低于空白对照组（P<0.01）。结论 黄芪解毒可诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡,显著降低β-catenin、 C-myc基因表达,该结果为黄芪解毒汤在乳腺癌术后治疗中的应用提供实验依据。     

小麦 TaAGL7 N基因的Real time PCR检测

为了建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR方法，测定 TaAGL7 N基因在小麦不同器官的表达水平。采用 RT PCR扩增小麦 TaAGL7 N基因片段，建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线，以18S rRNA为内参，检测小麦不同器官中的 TaAGL7 N表达水平。结果表明，标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系，熔解曲线分别在82.8～83.6 ℃和83.1～85.6 ℃各仅有一个单峰。成功建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR法，该方法具有特异度和敏感度高、 稳定性好的特点，可用于定量测定小麦中TaAGL7 N的表达水平。     

桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（BdorSer）的克隆与表达分析

【目的】克隆桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（Bactrocera dorsalis serine protease,BdorSer）,研究BdorSer在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其可能参与的生理过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆BdorSer,对其编码蛋白氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究BdorSer mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了BdorSer,该基因ORF全长1 239 bp。氨基酸序列一致性分析表明,BdorSer与拟暗果蝇（Drosophila pseudoobscura）丝氨酸蛋白酶（登录号XP_001352960）氨基酸序列的一致性最高,为65.8%。实时荧光定量PCR分析表明,BdorSer mRNA在桔小实蝇雌雄虫的不同组织中都有表达,且在触角中的表达量最高,分别是雌虫胸部的43.6和26.8倍。BdorSer mRNA在生殖节中表现出较大的性别差异表达特征,雄虫生殖节中的mRNA表达量是雌虫的18.25倍。BdorSer mRNA几乎在昆虫发育的各个时期都有表达,其中在卵及1,2,3龄幼虫中的表达量分别是10 d 蛹的 0.68,1.63,4.31和15.8倍。BdorSer mRNA随蛹的发育其表达量逐渐减低,1,4,7 d蛹中的表达量分别是10 d蛹的325,125和41倍。【结论】克隆获得了BdorSer,其表达的BdorSer蛋白可能在雄虫的生殖生理中发挥了作用,同时也可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其是1 d蛹的发育过程。     

长白和蓝塘猪印记基因 IGF2 和 H19 的时空表达研究

运用实时荧光定量PCR技术,检测 IGF2和H19 印记基因在长白猪和蓝塘猪中的表达水平.测定了1日龄和180日龄2个阶段的基因在各组织中的转录表达水平,按照生长性状分组,对组间的表达差异进行了比较分析.分析不同日龄长白、蓝塘猪各组织中 IGF2、H19 的表达量.结果显示,仔猪初生体质量大的组肝脏组织中 IGF2 基因表达水平显著高于初生体质量轻的组;180日龄猪皮脂厚的组脂肪组织的 IGF2 基因表达量高于皮脂薄的组;1日龄仔猪肝脏、肌肉和胃组织中 IGF2 表达量高于其他测定组织和180日龄的各组织;180日龄蓝塘猪肾脏组织中的 H19 表达量显著升高.     

西瓜渗调蛋白ClOsm基因克隆及其编码蛋白的抑菌活性

【目的】克隆西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. et Nakai）渗调蛋白基因ClOsm,明确该基因编码蛋白的抑菌活性,为进一步研究ClOsm基因功能并开展西瓜抗病分子育种奠定基础。【方法】采用同源克隆法,克隆西瓜ClOsm基因,分析其序列特征,并构建系统进化树。利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术分析ClOsm基因的表达特征。利用原核表达系统表达并纯化His-ClOsm重组蛋白,检测其对枯萎病菌、蔓枯病菌、白粉病菌、茄病镰刀菌和轮枝镰刀菌的体外抑菌活性。【结果】从枯萎病菌侵染的西瓜根系组织中克隆到渗调蛋白基因ClOsm（GenBank登录号为MF445019）,其长度为768 bp,编码255个氨基酸,预测蛋白质分子质量为27.52 ku,等电点为7.78。氨基酸结构分析显示,ClOsm含有TLP蛋白的保守结构域。系统进化分析表明,ClOsm与冬瓜BhOsm蛋白的亲缘关系最近,相似度达95%,且归为osmotin类型的类甜蛋白。实时荧光定量分析显示,ClOsm基因在西瓜根、茎、叶组织中均有表达,根中表达量最高;枯萎病菌侵染能够显著诱导ClOsm基因的表达,在侵染120 h时表达量最高。融合蛋白His ClOsm体外抑菌活性检测结果表明,ClOsm蛋白可以显著抑制枯萎病菌、蔓枯病菌、白粉病菌、茄病镰刀菌和轮枝镰刀菌等病原菌的生长,抑制率分别为70.2%,60.8%,65.3%,55.4%和46.6%。【结论】克隆了西瓜ClOsm基因,并纯化得到ClOsm重组蛋白,该蛋白能够显著抑制病原真菌的生长。     

延胡索去甲乌药碱合成酶基因CyNCS1克隆及其表达模式分析

【目的】克隆延胡索去甲乌药碱合成酶（norcoclaurine synthase,NCS）基因,分析其在延胡索异喹啉类生物碱合成中的关键作用。【方法】基于转录组数据库,利用逆转录PCR克隆延胡索CyNCS1基因及其启动子区域序列,采用生物信息学方法分析其编码蛋白的理化性质、结构特征及其启动子区域顺式作用元件,同时进行多序列比对和系统进化树分析,确定其进化关系;利用实时荧光定量PCR对其根、茎、叶及发育早、中、晚期块茎的组织表达模式进行分析;对茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）处理0,4,8,12 h的叶片进行表达谱分析,以体积分数75%酒精溶剂处理为对照（CK）,确定该基因的表达特征。【结果】CyNCS1基因开放读码框长873 bp,编码291个氨基酸,编码蛋白分子量为33.09 ku,等电点为6.90,具有去甲乌药碱合成酶保守的催化结构域（GDGGVGTV/IL、YKEKF和MIEGGHLDMG）,且不含信号肽,预测定位于细胞核中。多序列比对结果显示,CyNCS1与石生黄堇、罂粟的NCS蛋白同源性较高,分别为83.6%和82.1%;系统进化树结果显示,CyNCS1与石生黄堇CsNCS蛋白聚为一支,说明二者亲缘关系较近。该基因启动子区长2 238 bp,包含多种植物激素及低温、热胁迫等环境因子的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果显示,随着发育推进块茎中CyNCS1的表达量显著增高,且受到MeJA和ABA的诱导,MeJA处理8 h时表达量为0 h的3.10倍,ABA处理8 h为0 h的3.16倍;而对照CyNCS1表达量随时间推移无明显变化。【结论】克隆并鉴定了延胡索NCS酶基因CyNCS1,明确了其在发育进程中的表达模式,并确定该基因表达受MeJA和ABA的诱导。     

猪THRSP基因5'调控区多位点SNP联合效率的研究

旨在分析猪THRSP基因5’调控区多位点SNP联合调控THRSP基因表达的效率。实验从猪基因组获取包含多位点SNP的目的片段,利用荧光素酶报告基因pGL3-Basic构建表达载体,检测多位点SNP 的联合启动效率,并通过实时荧光定量PCR进行THRSP基因表达验证分析。结果表明,在5个SNP位点中,TCAGA 的启动效率最高,比CTGGA的启动效率高129％,而CCAGA、CTAGA和CTGAT的启动效率较CTGGA分别低99.0%、73.2％和42.6％。TCAGA的启动效率较CCAGA高75.6％,而CCAGA比CTAGA的启动效率高96.6％;报告基因所揭示的SNP启动效率与THRSP基因实时荧光定量PCR结果一致。     

蒲公英抗氧化酶基因的克隆与盐胁迫表达分析

利用同源克隆技术从蒲公英中克隆到铜锌超氧化物歧化酶基因（Cu/ZnSOD）、抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）和过氧化氢酶基因（CAT）3个抗氧化酶基因,采用生物信息学方法分析基因编码的氨基酸序列,利用实时荧光定量PCR方法对盐胁迫下的基因表达进行检测,以了解盐胁迫下抗氧化酶系统变化机理。结果显示：蒲公英Cu/ZnSOD、APX和CAT的编码区序列长度分别为474、852和1 479 bp,分别编码157、283和492个氨基酸残基的抗氧化酶。多序列比对和物种进化关系表明,蒲公英3个抗氧化酶基因与莴苣和向日葵中相关基因的氨基酸序列同源性最高;与0 h相比,盐胁迫处理3 h和6 h时,3个抗氧化酶基因的表达量迅速增加,12 h时又有所降低;海水复合盐胁迫对Cu/ZnSOD的影响相较于NaCl单盐胁迫有所提高。综上所述,盐胁迫快速诱导了蒲公英抗氧化酶基因的表达,以抵抗逆境胁迫,但经过一段时间的高盐胁迫后,过量的活性氧在植株内大量积累,对其细胞造成严重的损害,酶活性降低,植株正常生长受到抑制,细胞内基因的表达亦受到影响。     

miR-192在尼罗罗非鱼应答碱度胁迫中的表达及靶基因

采用实时荧光定量、生物信息学、双荧光素酶报告和体内miRNA抑制的方法,探究miR-192在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）应答碳酸盐碱度胁迫中的作用。结果如下：（1）实时荧光定量PCR实验表明,在急性碱度胁迫（6 g/L NaHCO₃）尼罗罗非鱼6 h后,鳃组织中miR-192的表达显著下调,溶质转运蛋白基因（solute carriers16A7,SLC16A7）表达显著上调（P<0.05）;（2）借助生物信息分析预测到SLC16A7可能是miR-192的靶基因;（3）利用双荧光素酶报告实验发现miR-192会与SLC16A7的3''UTR结合;（4）体内对miR-192抑制后,SLC16A7的表达显著上调（P<0.05）。证实了miR-192参与了尼罗罗非鱼应答碱度胁迫中的调控过程,SLC16A7是miR-192的直接靶基因,为探明miRNAs调控尼罗罗非鱼应答碱度胁迫的分子机制提供了一定的依据。     

矮牵牛海藻糖-6-磷酸合酶基因 PhTPS6的克隆与表达分析

以矮牵牛(Petunia hybrida var.Mitchell)为材料,利用PCR方法克隆得到海藻糖-6-磷酸合酶基因6(TPS6)(Trehalose-6-phosphate synthase 6)的同源基因PhTPS6。生物信息学分析显示:该基因cDNA全长为2 571bp,编码856个氨基酸,推测PhTPS6蛋白的分子式为C4342H6838N1154O1276S48。利用实时荧光定量PCR分析PhTPS6在不同组织、不同处理下的表达特性。结果显示:PhTPS6基因在叶腋中表达量较高,而在叶片中的表达量最低;去顶6h引起PhTPS6的表达量升高至对照的14倍,24h后表达量显著下降。而去顶后施加生长素则抑制去顶对PhTPS6的调控。施加细胞分裂素6h后PhTPS6的表达水平显著上调至对照的16倍,随着处理时间的增加,其表达水平逐渐下降。低温处理12h以及盐胁迫处理12h导致PhTPS6表达量分别上调至对照的18.9倍和21.4倍,且随着时间的增加表达量持续上升。该研究表明PhTPS6在矮牵牛分枝发育及低温和盐胁迫中均具有重要作用。     

花绒寄甲Caspase-1基因在不同虫态的表达

为明确花绒寄甲Caspase-1基因及其蛋白酶活性在不同虫态中的表达特性,采用RT-PCR和Caspase酶活测定方法进行研究。结果表明:Caspase-1酶活性变化趋势与其基因表达趋势基本一致,Caspase-1基因及其蛋白酶在5龄幼虫期和蛹期有较高的活性,且其活性高于所有成虫期;成虫期随存活时间的延长,Caspase-1酶活性总体呈现增长趋势。Caspase-1及其酶活在不同虫态中表达规律的揭示,为研究Caspase-1基因与花绒寄甲生理代谢和寿命关系提供依据。     

凡纳滨对虾繁育相关基因Allatostatin-AR的克隆与表达分析

咽侧体抑制素主要抑制昆虫咽侧体保幼激素的分泌,是昆虫体内重要的神经肽,在甲壳动物体内可能参与繁殖发育的调节。本研究利用RACE PCR技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)A型咽侧体抑制素受体(Allatostatin-A receptor,AST-AR)基因进行克隆,获得全长为2 650 bp的cDNA,包括1 425 bp的开放阅读框,1 170 bp 5''非编码区,55 bp 3''非编码区,编码474个氨基酸,形成具有7个跨膜区的不稳定亲水性蛋白。同源性和系统发育分析结果表明凡纳滨对虾AST-AR基因与斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示AST-AR氨基酸TM7后C末端精氨酸在不同物种之间高度保守。实时荧光定量PCR结果显示,AST-AR基因在雌、雄凡纳滨对虾多个组织(眼柄、脑、胃、肝胰腺、鳃、性腺、肠、肌肉)中均有表达,除脑组织外AST-AR基因在雌性凡纳滨对虾中相对表达量高于雄性。在幼体发育中,AST-AR基因的相对表达量随发育阶段上升,同时该基因在不同群体仔虾生长对比实验中表达量差异显著。据此推测AST-AR基因参与凡纳滨对虾的繁殖、幼体发育、幼虾生长到成虾,基因表达基本贯穿凡纳滨对虾的一生。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

红花CtMYB-TF1基因的克隆与表达分析

为了探索R2R3-MYB转录因子与植物类黄酮的次生代谢调控之关系,及对植物花青素合成代谢的作用,以红花花瓣为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术,从红花(Carthamus tinctorius)中克隆获得1个全长1 260 bp的调控花青素代谢的 CtMYB-TF1基因。结果表明,该基因序列可编码249个氨基酸,其蛋白质分子质量为28.08 ku;红花CtMYB-TF1蛋白分子式为C_(1220)H_(1930)N_(358)O_(378)S_(13),是一种不稳定的碱性亲水蛋白;由系统进化树分析可知,红花 CtMYB-TF1与葡萄 VvMYBPA1亲缘关系较近;通过RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,红花 CtMYB-TF1基因在花期的各个时期相对表达量均高于红花CtANS基因,并且随着花期的延长红花 CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高,其中在花期的第5天红花 CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值,说明 CtMYB-TF1基因对CtANS基因具明显的上调作用,可为构建高产、稳定的红花基因工程改良细胞株提供参考。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

小麦TaSIM基因结构及表达分析

根据小麦TaSIM基因的cDNA序列设计引物,采用PCR技术从小麦中克隆TaSIM基因的DNA序列,采用半定量RT-PCR方法研究TaSIM基因在不同组织中的表达。结果表明:TaSIM编码区DNA序列长度为2 355bp,包含2个外显子和1个内含子。分析发现内含子富含AT,在内含子中发现2个MYB转录因子结合位点。半定量RT-PCR检测表明,TaSIM基因在不同组织中均有表达,在雄蕊中的表达量最高。TaSIM表达量依次为雄蕊>雌蕊>根>茎>叶。     

pH对产叶酸植物乳杆菌叶酸产量及相关基因表达的影响

叶酸是细胞代谢的重要中间体,人类由于缺乏叶酸生物合成途径中的关键酶,需要从膳食中摄取叶酸。由于谷氨酸尾数目的差别,生物合成的叶酸更容易被人体利用。一些植物乳杆菌菌株可以合成叶酸,但培养条件对叶酸合成有较大影响。选择一株高产叶酸的植物乳杆菌4_3菌株,探讨了在同一培养基中,不调节pH和使pH稳定在6.0对其生长状况和叶酸合成的影响。比起不调节pH,维持pH 6.0可以长期保持较高的活细胞密度。实时荧光定量PCR的结果显示,在pH 6.0的培养基中,叶酸合成相关基因表达量均要高于不调节pH的培养基。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

Effect of the Antisense BcMF12 Driven by the BcA9 Promoter on Gene Silencing in Brassica campestris L. ssp. chinensis

The study analyzed the silencing of BcMF12 gene regulated by BcA9 promoter in the transgenic pakchoi and confirmed the effect of antisense BcMF12 gene on the pollen development. A conserved BcMF12 gene fragment was amplified from the cDNA of flower buds in pakchoi （Brassica campestris L. ssp. chinensis, syn. B. rapa L. ssp. chinensis） and was fused to the anther specific BcA9 promoter. The plant antisense expression vector was constructed and then introduced into pakchoi via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants were screened by antibiotics and molecular analysis. PCR and Southern blot revealed that the antisense BcMF12-GUS fusion gene regulated by BcA9 promoter was integrated into transgenic plants. Northern blot suggested that the expression of BcMF12 gene was down-regulated significantly. The pollen germination rate of transgenic plants with antisense BcMF12 gene decreased as compared with that of the control plants. The expression of the gene BcMF12 related to the pollen development was inhibited by the antisense BcMF12 driven by BcA9 promoter, which consequently affected the pollen development in pakchoi.