基于转录组测序技术的黄唇鱼SSR分子标记筛选

[目的]筛选出可用于黄唇鱼(Bahaba flavolabiata)遗传资源评价及亲缘鉴定的SSR分子标记,为开展其保护遗传学研究打下基础.[方法]利用Illumina HiSeq 4000测序平台对野生黄唇鱼样本进行转录组测序,采用TGICL对转录组数据进行聚类去冗余以获得Unigene,并通过生物信息学方法进行功能注释分类、代谢通路和SSR特征分析等.[结果]黄唇鱼混合组织的转录组测序共获得13.43 Gb数据,经组装并去冗余后获得65047条Unigenes.采用BLAST对组装获得的Unigenes进行七大功能数据库(NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro)注释,结果共有55583条Unigenes被注释(占85.45%).通过MISA对黄唇鱼的Unigene进行SSR搜索,共检测到29797个SSR位点分布于19664条Unigenes中.SSR位点分布类型及其特征分析结果显示,最主要的重复类型为二核苷酸重复基元(11855个,占39.79%),其次是单核苷酸重复基元(9695个,占32.54%)和三核苷酸重复基元(6663个,22.36%),而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基元的数量相对较少.二核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AC/GT(8355条),在三核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AGG/CCT(1866条).从随机选取的186对SSR引物中,最终筛选出47对扩增稳定性好且具有多态性的SSR引物,以二核苷酸和四核苷酸重复基元的扩增结果居多.[结论]通过转录组测序能有效筛选出具有多样性的黄唇鱼SSR分子标记,可为黄唇鱼的遗传多样性分析、亲缘鉴定和遗传图谱构建等后续研究提供基础资料.     

基于银鲳RNA-seq数据中SSR标记的信息分析

[目的]开发银鲳分子标记技术。[方法]通过对银鲳(Pampus argenteus)进行高通量转录组测序(RNA-seq)获得银鲳转录组原始试验数据,经过拼接后,获得3 715 603条unigene序列。采用生物信息学分析软件MISA对所有unigene进行简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)位点鉴定。同时,利用软件对银鲳转录组SSR的多态性进行评价。[结果]银鲳转录组水平上,共鉴定出107 007个SSR位点,分布在97 289条unigene中,发生频率为2.62%,SSR平均密度为476个/Mbp。在银鲳转录组SSRs中,单核苷酸与二核苷酸重复序列为主要重复类型,分别占总SSRs的48.14%和34.10%。银鲳转录组数据中SSR序列共包括424种重复基元类型,单核苷酸重复基元A占较高比例,占同一重复类型SSRs的49.57%,二核苷酸重复基元TG/AC和三核苷酸重复基元GAG/AAC是优势重复基元,分别占同一重复类型SSRs的42.43%和9.61%。重复序列长度在12 bp以上的SSR标记位点数占总SSR的76.95%,具有丰富的多态性。[结论]银鲳SSRs位点具有极大的可开发性,可为银鲳遗传多样性研究、遗传图谱构建及分子辅助育种提供有效工具。     

3种白鲫杂交子代的转录组学分析

[目的]研究3种白鲫杂交子代转录组学特征,为揭示鲫鲤杂交优势的分子机理提供理论依据,同时为在生产上培育出生长速度快、肉质好、适应能力强的杂交品种提供技术参考.[方法]以白鲫(♀)×黑龙江野鲤(♂)杂交子代(简称HB)、白鲫(♀)×散鳞镜鲤(♂)杂交子代(简称SB)和白鲫(♀)×兴国红鲤(♂)杂交子代(简称XB)为研究对象,利用RNA-seq高通量测序技术构建3种白鲫杂交子代转录组文库,以HiSeq PE150进行测序分析,原始序列经Trinity组装后进行功能注释(E-value<1e-5);以DESeq2 R鉴定差异表达基因,利用GOseq R和KOBAS分别对差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析;并采用MicroSAtellite对转录本中的SSR位点进行挖掘.[结果]共组装得225858条unigenes,平均长度为668 bp,N50为938 bp,有171461条unigenes可注释到蛋白质数据库(Nr)、非冗余核苷酸数据库(Nt)、蛋白质序列数据库(SwissPort)、基因本体论(GO)、直系同源基因簇(COG/KOG)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中,注释比例为75.92%.其中,52630条unigenes注释到NR数据库,43659条unigenes注释到SwissPort数据库,35756条unigenes注释到COG/KOG数据库,包括生化代谢、信号转导机制、防御系统和细胞结构等.差异表达基因KEGG分析结果显示,较多的差异表达基因注释到内吞作用、Jak-STAT信号通路、溶酶体、吞噬体和Wnt信号通路等免疫相关及与生长发育相关的MAPK信号通路、Hippo信号通路和背腹轴形成等通路中.此外,从获得的转录组序列中共鉴定出20272个SSR位点,大多数为二核苷酸重复基元(占62.15%).[结论]不同白鲫杂交子代间存在较多的差异表达基因,从中获得参与抗氧化、免疫和生长发育相关的通路和基因序列,且挖掘出20272个SSR位点,有助于选择性育种、分子标记开发及开展遗传多样性、遗传图谱构建和QTL定位等研究.     

基于转录组学测序的长白落叶松材性表达基因

基于边合成边测序(Sequencing By Synthesis,SBS)技术,使用Illumina Hi Seq2500高通量测序平台对长白落叶松c DNA文库进行测序。共获得非重复序列基因58 683条,总长度为55 283 938 bp。将得到的转录本使用BLAST软件将非重复序列基因序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG数据库比对,通过选择BLAST参数Evalue不大于10-5,最终获得29 350个有注释信息的基因序列,其中19 292个转录本注释GO编号,有9 112个转录本在COG数据库中被注释并分为25个功能分类,同时注释到120条KEGG代谢途径。在得到注释的转录本中搜索到木质素相关基因共68条,其中与木质素合成相关基因29条,与木质素分解代谢相关基因27条;找到了147条纤维素相关基因,其中与纤维素合成相关基因103条,与纤维素分解代谢相关基因44条。     

秀珍菇原基形成相关基因PpFBD1的克隆与表达研究

前期研究中通过对秀珍菇经低温诱导后不同发育阶段样本进行转录组测序及差异表达基因分析发现,ID为Cluster-6377.64510的基因(命名为PpFBD1)在原基形成前期的样本中高表达。为进一步了解分析其表达特性及功能,根据转录组测序结果设计特异性引物,利用RT-PCR技术从秀珍菇中克隆获得了该基因的cDNA全长。该基因由342个核苷酸组成,编码一个由113个氨基酸组成的蛋白,蛋白相对分子质量约11 ku。进化树分析显示,PpFBD1编码蛋白与糙皮侧耳hydrophobin1编码的疏水蛋白亲缘关系最近。Gene Ontology功能分析表明,PpFBD1主要参与真菌类细胞壁的合成。荧光定量RT-PCR检测显示,该基因在菌丝体经低温诱导后恢复至室温阶段(原基形成前期)表达量最高,这表明其可能参与调控秀珍菇原基形成过程。本研究结果为阐明秀珍菇原基形成机制提供参考。     

红脚艾蒿的转录组解析

[目的]利用高通量测序技术解析红脚艾(Artemisia rubripes Nakai)的转录组信息特征.[方法]通过高通量测序平台Illumina HiSeq 2500对红脚艾进行转录组测序,通过Trinity软件de novo组装获得Unigene,并基于序列同源性对Unigene进行功能注释,得到红脚艾的转录组信息.[结果]测序数据经过质控后共获得24126043条高质量的reads,通过de novo组装获得173093个转录本,对组装的转录本去冗余后共获得85991个Unigene,平均长度为616.87 bp,N50为925 bp.共有47216个Unigene在NR、KEGG、COG、KOG、GO数据库获得功能注释,40802个Unigene在NR数据库注释,显示红脚艾与向日葵(Helianthus annuus)的单基因匹配率最高,16846个Unigene被KEGG数据库注释到130条代谢途径中,26171个Unigene被注释到25个KOG功能分类中,23203个Unigene被GO注释到生物过程、细胞组成和分子功能三大类51个功能分类,12810个Unigene被注释到25个COG功能分类中.[结论]利用高通量测序技术获得了红脚艾转录组信息特征,这些数据将为后期开展功能基因鉴定、解析化合物次生代谢途径及其调控机制奠定研究基础.     

黑紫色叶紫薇品种‘赤红’叶片转录组测序及注释分析

对黑紫色叶紫薇品种‘赤红’叶片进行高通量测序,并利用Trinity(2.8.6)对测序数据进行从头组装,共获得23 791条unigene,其中91.86%的序列在NR、GO、COG、KEGG等5大数据库中得到注释;NR数据库比对到的unigene数量最多,占比91.93%,随后依次为SWISS(67.95%)、COG(60.43%)、GO(51.37%)和KEGG(35.43%)。在NR数据库中,‘赤红’紫薇所有的unigene仅比对到1个物种——石榴（Punica granatum L.）,表明同属于千屈菜科的紫薇和石榴亲缘关系较近。从转录组中共筛选到4 775个SSR位点,包括6种核苷酸重复类型,其中A/T和AG/CT类型占比最高。对色素合成相关通路基因进行分析,共挖掘到18个与类黄酮和花青素相关的基因,其中花青素合成通路中的UGT79B1、BZ1、UGT75C1可能是‘赤红’紫薇形成紫黑色叶的关键基因。     

枸杞转录组SSR分布特征分析及其与基因组SSR分布特征的比较

通过Illumina Hi Seq 2500高通量测序平台,利用RNA-Seq技术对青杞1号品种整体转录活动进行检测,并对得到的序列采用生物信息学手段进行拼接后查找SSR,然后与基因组SSR进行比较。结果显示,转录组共获得5 411个重复单元长度为2~6碱基的微卫星重复序列,2碱基重复的微卫星最为丰富,共2 666个,占49.27%,其中AG/CT基序的重复数量最多;3碱基重复类型有2 609个,占重复序列总数的48.22%;4碱基重复118个,5碱基重复10个,6碱基重复8个,分别占重复序列总数的2.18%、0.18%、0.15%。而基因组共获得14 733个重复单元为2~6碱基的微卫星重复序列,3碱基重复的微卫星最为丰富,共9 799个,占66.51%,其中GTT/CAA基序的数量最多。青杞1号转录组SSR与基因SSR在重复序列分布上存在显著差异。     

鲫鱼血液、肝脏、卵巢组织转录组比较分析

为进一步丰富鲫鱼基因组数据，对肝脏、血液和卵巢组织进行高通量转录组测序。采用Illumina Hiseq高通量测序平台进行转录组测序，对所获得序列进行比对、基因注释、差异表达和SNP、SSR分析。结果提示，组装得到127 801条unigene,平均长度为735 bp。与相应数据库比对，最终获得117 414(91.87%)个有注释信息的unigene,有105条unigene获得GO注释，并分类到生物学过程、细胞组分和分子功能三大类42个功能中；有20 725条unigene被归纳到KOG的26个直系同源功能类型；获得KEGG注释的unigene共参与五大类32小类代谢通路。在鲫鱼肝脏、血液和卵巢组织中分别检测到307 740、343 516、348 795个SNP位点，共检测到48 808个SSR位点。提示获得有注释信息的unigene共117 414条，此外，获得一些SNP和SSR位点。结果可为进一步克隆和挖掘鲫鱼功能基因、多态性检测及群体遗传多样性分析等方面研究奠定基础。     

大竹蛏高通量转录组测序数据组装和分析

为进一步开发大竹蛏Solen grandis的基因资源,采用2代Illumina Hi-seq测序技术对大竹蛏的鳃组织进行了转录组测序,构建了转录组数据库,获得338 483 476条Clean Reads数据;拼接组装后获得190 856条Unigene数据,平均长度为1147 bp;与NR、NT、KO、Swiss Prot、PFAM、GO、KOG等数据库进行Blast信息比对(E-value为10-5),共获得63 337个注释基因;与NR数据库比对发现,大竹蛏转录组基因序列与长牡蛎Crassostrea gigas具有较高的同源性,为53.3%;将大竹蛏转录组的Unigene的功能通过与KOG数据库进行注释比对划分为25类;GO数据库注释可分为三类,即细胞组分、生物过程和分子功能,共包括65个分支;KEGG分析发现,大竹蛏转录组数据中按照代谢通路可分为92类,利用Blast蛋白库比对和Estscan软件进行ORF预测,获得长度大于300 nt的ORF共50 681个;通过SSR分析,共获得73 089个SSR标记。本研究中获得的转录组信息可为今后进行大竹蛏分子标记的开发和关键基因的克隆及功能分析等研究提供基础数据。     

基于牡丹涝害胁迫的转录组分析及SSR引物开发

涝害胁迫是限制牡丹种植、生长和高产的最主要的非生物胁迫之一。为了阐明牡丹在涝害胁迫下的作用机制,研究进行了转录组学分析,并开发了SSR标记。利用高通量测序对6个由涝害处理的幼苗和对照的mRNA构建的cDNA文库进行测序。通过组装总共获得73 925个基因,创建了牡丹的初始参考转录组数据库。其中780个被鉴定为涝害早期反应基因,其中155个基因上调,625个基因下调。功能分析表明,参与转录因子信号调节、DNA复制、核糖体和嘧啶代谢的基因表达的改变可能在牡丹对涝害胁迫的反应中发挥重要作用。基于这些高通量转录组测序数据,挖掘出5 204个SSR标记。在这些标记中,二核苷酸重复占58.13%,三核苷酸重复占27.11%,四核苷酸重复占7.24%。在牡丹耐涝性状靶基因相关的功能注释基因中,发现了110对SSR标记引物,筛选出45对引物,其中12对能扩增出清晰的条带,多态性SSR标记引物占引物总数的26.67%。研究结果不仅有助于阐明牡丹的涝害反应机制,同时也为耐涝牡丹品种的分子标记辅助选择育种提供了宝贵的基因组资源和科学依据。     

超声波提取秀珍菇菌丝体多糖的工艺优化

[目的]研究秀珍菇菌丝体多糖的最佳提取工艺。[方法]采用超声波法提取秀珍菇菌丝体多糖,研究料液比、提取时间、超声功率等因素对多糖提取率的影响;并在此基础上,通过正交试验优化最佳提取工艺。[结果]秀珍菇菌丝体多糖超声提取的最佳工艺为:料液比1∶80 g/ml,提取时间50 min,超声功率60 W。在此条件下,秀珍菇菌丝体多糖的提取率为25.52%。[结论]试验优化的工艺稳定可行,适合秀珍菇菌丝体多糖的提取。     

miR-146a过表达羊驼黑色素细胞内转录组图谱分析

miR-146a在一些癌症生理学过程如肺癌、肝癌、黑色素瘤中具有重要的调节作用。为了揭示miR-146a在羊驼黑色素细胞中的生物学功能,利用RNA-Seq的高通量测序技术从基因组转录水平解析miR-146a可能的分子作用机制,经Illumina sequencing平台测序并进行生物信息学分析。结果表明,miR-146a转染组和对照组羊驼黑色素细胞的转录表达谱,各样品纯数据均达到6.34 Gb,Q30碱基百分比在87.44%以上;组装后共获得161 666条序列,其中长度在1 kb的序列有20 019条。对序列进行功能注释,包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对,结果显示,共获得25 867条序列的注释结果,其中,SSR分析共获得10 963个SSR标记。功能分析结果表明,这些表达基因涉及多种GO分类及KEGG通路且与黑色素相关的GO分类和KEGG通路占有较大比例。结果显示,研究miR-146a在黑色素细胞中的功能及其分子机制,并获得了黑素细胞转录组图谱,可为进一步研究控制羊驼毛色生理和色素生成的基因表达网络提供宝贵的资源。     

黄芩高通量转录组测序数据组装和分析

采用高通量测序技术对黄芩的转录组进行测序,获得了29 099 899条reads数据,拼接后得到53 353条Unigene;将所获得的Unigene与COG,GO,KEGG,Swiss-Prot,NR这5个公共数据库进行比对,结果发现,分别有10 756,21 950,8 101,20 339,29 288条Unigene可比对到以上5个数据库中;已注释的Unigene与COG数据库比对后按功能可分为25类;根据GO功能可分为三大类57个亚类;经过与KEGG数据库比对后按照代谢通路可分为116类;利用Get ORF软件进行ORF预测,获得长度大于300 nt的ORF共20 552个;通过SSR分析,共获得5 658个SSR标记。获得的转录组信息可为今后进行黄芩分子标记的开发和关键基因的克隆及功能分析等研究提供基础数据。     

生物土壤结皮土生对齿藓转录组SSR位点分析

[目的]分析生物土壤结皮土生对齿藓转录组SSR位点。[方法]以生物土壤结皮土生对齿藓为材料,分析土生对齿藓转录组数据,开发土生对齿藓SSR分子标记技术。[结果]通过MISA软件对土生对齿藓高通量测序获得的73 084条unigenes进行SSR筛选。从搜索序列中发现4 103个符合条件的SSRs,分布在3 420条unigenes上,出现频率为5.62%。三核苷酸和二核苷酸为主要重复类型,分别占SSR总数的47.9%和26.1%,AGC/CTG(31.9%)和AG/CT(75.5%)分别是其主要重复基元。69.0%的基序长度为12~20 bp。[结论]土生对齿藓转录组SSR位点出现频率高、类型丰富、多态性潜能大,为土生对齿藓分子生物学机制研究等方面提供理论依据。     

基于高通量测序的北柴胡根转录组SSR位点信息分析

以北柴胡根为试材,采用高通量转录组测序方法,获得uingene序列信息,研究分析SSR分布、基元特征,设计、验证EST-SSR引物的有效性,为开发、丰富EST-SSR分子标记奠定基础。结果表明：从北柴胡根转录组中共筛选到31 176个SSR位点,分布于21 732条unigenes,出现的频率为20.08%,分布密度为3.20个/10 kb,主要重复基元类型以二核苷酸最为丰富,共21 056个,占SSR位点总数的67.54%;其次是单核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR的19.05%和12.07%;四核苷酸～六核苷酸重复基元数量均较少。不同核苷酸基序类型共有131种基元,重复基元次数在5～11次的数量最多,占SSR总数的91.7%,且长度基本小于15 bp,其中AT/AT和AC/GT这两种基元在二核苷酸中出现频率最高。2 064条和1 004条含有SSR位点的unigenes分别注释到GO和KEGG通路,获得注释的基因功能主要与基础代谢相关。从22 090对具有潜在多态性的EST-SSR引物中,随机挑选20对引物对3个北柴胡种质DNA进行PCR扩增,扩增成功率最高达85%。北柴胡根转录组S...     

香榧转录组测序及生物信息学基础分析

香榧具有重要的经济价值,但其基因组信息相对匮乏,限制了其分子生物学和基因功能的研究。本文以不同组织的香榧作为研究对象,采用新一代高通量测序技术平台Illumina Hi Seq?2000对香榧转录组进行测序和数据分析,共得到37,349,086个reads片段,总碱基数为4.35 G。利用组装软件,对获得的高质量序列进行组装,共得到104,636个Unigene,平均长度为784 nt,N50为1,702。将Unigene序列与公共数据库进行比对,28,766个Unigenes获得了注释。其中26,856个Unigene在NR蛋白数据库中获得注释,24,003个Unigenes在NT数据库中获得注释,21,401个Unigene在Swiss-Prot蛋白数据库中获得注释,16,137个Unigene在COG数据库中获得注释,11,410个Unigene在GO数据库中获得注释。根据KEGG注释信息,18,564个Unigene被划分到256个代谢途径中。SSR位点搜索发现,在4,217个Unigene中含有4,706个SSR位点。分析所获得的转录组数据,将为香榧功能基因的克隆,基因的表达,指纹图谱构建和分子标记辅助选育奠定基础。     

基于RNA-Seq的杜仲转录组微卫星特征分析

对杜仲(Eucommia ulmoides)国审良种‘华仲6号’和‘华仲10号’花后70和160d的种仁共4个样本进行转录组测序,对测序数据进行组装和功能注释分类,并对转录组获得的单基因簇(unigene)进行微卫星特征分析。利用新一代高通量测序技术Illumina HiSeq~(TM)2000对杜仲样品进行转录组测序,采用软件Trinity进行组装;利用BLAST软件将unigene序列分别与Nr、GO、COG和KEGG等数据库比对分析;利用MISA软件对转录组的96 469条unigenes进行SSR搜索。结果表明:转录组测序分析,共得到72 791 399个高质量的序列读取片段(Clean reads),包含了14 702 548 161个的碱基序列(bp)信息。对reads进行序列组装,共获得96 469个平均长度为690bp的unigene,序列信息量达到了66.56 Mb。同源性分析结果显示,有49 856个与其它物种同源的unigenes得到注释,占All-unigene的51.68%。将杜仲转录组中的unigene与GO数据库进行比对分析,根据其功能可将注释到的38 983条unigene分成3大类(细胞组分、分子功能和生物学过程)56个分支;根据COG功能可将注释的14 796条unigene基因划分成25个类别;KEGG数据库作为参照,可将注释到的11 260条unigene定位到117个代谢途径分支;SSR位点搜索结果显示,96 469条unigenes中共包含9 621个完整型SSR位点,占总SSR位点的84.14%。完整型SSR位点共包含55种重复基元,其中出现频率最高的重复基序类型为单核苷酸重复中的A/T(4 597个),其次是AG/CT(2 597个)、AT/AT(439个)。     

基于转录组学测序的长白落叶松材性表达基因1）

基于边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ,SBS）技术,使用Illumina HiSeq2500高通量测序平台对长白落叶松cDNA文库进行测序。共获得非重复序列基因58683条,总长度为55283938 bp。将得到的转录本使用BLAST软件将非重复序列基因序列与NR、Swiss－Prot、GO、COG、KEGG数据库比对,通过选择BLAST参数E－value不大于10－5,最终获得29350个有注释信息的基因序列,其中19292个转录本注释GO编号,有9112个转录本在COG数据库中被注释并分为25个功能分类,同时注释到120条KEGG代谢途径。在得到注释的转录本中搜索到木质素相关基因共68条,其中与木质素合成相关基因29条,与木质素分解代谢相关基因27条;找到了147条纤维素相关基因,其中与纤维素合成相关基因103条,与纤维素分解代谢相关基因44条。