猪带绦虫10 ku蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其初步应用

将猪带绦虫六钩蚴10ku蛋白（TS010）和囊尾蚴10ku蛋白（CE10）的基因克隆到表达载体中,构建重组表达载体pGEX-4T—TS010和pGEX-4T—CE10,经测序证明基因序列完全正确。重组表达载体转化大肠杆菌后诱导表达,用SDS-PAGE、Western—blot和薄层扫描检测表达产物。表达的目的蛋白纯化后用于血清样品ELISA检测。SDS-PAGE、Western—blot和薄层扫描检测结果表明,六钩蚴和囊尾蚴10ku蛋白基因均能在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白的相对分子质量约为35ku,并能被囊虫病人阳性血清所识别,具有反应原性,表达量分别占菌体蛋白总量的25％和30％。ELISA检测结果显示,10ku蛋白可用于囊虫病的诊断。     

猪带绦虫六钩蚴抗原基因的克隆与表达

以λｇｔ１１为载体构建了猪带绦虫六钩蚴ｃＤＮＡ文库，从中筛选出５株表达六钩蚴抗原成分的重组噬菌体。将其中的六钩蚴ｃＤＮＡ与表达质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ２连接，在ＴＧ１大肠杆菌中高效表达，获得了２株表达ＧＳＴ－六钩蚴抗原融合蛋白（Ｍｒ分别为５×１０４和６×１０４）的工程菌。在ＬＢ营养液中添加１％乳糖和０．２％葡萄糖，工程菌的表达效果优于用ＩＰＴＧ诱导的效果。融合蛋白约占工程菌总蛋白的２３％。     

牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E的原核表达、纯化及其圆二色谱分析

为了阐明牛分枝杆菌侵入宿主细胞和在肺泡巨噬细胞长期存活的机理，本研究以牛分枝杆菌的DNA为模板，通过PCR的方法扩增克隆牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E（Mammalian cell-entry protein 4E，mce4E）基因，将所扩增基因克隆于原核表达载体pET30a（＋）并进行测序，结果显示该基因与GenBank上所公布的牛分枝杆菌和人分枝杆菌mce4E基因同源性为100％。将重组表达载体转入宿主菌BL21进行诱导表达，表达蛋白经SDS-PAGE分析和Western-blotting免疫印迹鉴定，结果证明目的蛋白获得高效表达，表达量占菌体总量的53．3％，分子量约为45ku；利用Ni-NTA琼脂糖柱对表达蛋白进行纯化，纯化率大于95％；纯化的蛋白经过透析复性、圆二色谱（CD）测定，结果表明重组蛋白为典型的α螺旋型结构，经Jascow32软件分析计算，mce4E蛋白含有39．1％的α螺旋，60．9％的无规卷曲，无β-折叠和转角，为进一步开展牛分枝杆菌致病机理的研究和寻找新的药物作用靶位点奠定了基础。     

多头带绦虫Tm7基因的表达及间接ELISA检测方法的建立

以多头带绦虫Tm7重组蛋白为抗原,建立动物多头蚴病早期诊断方法.本研究从羊脑多头蚴原头节提取总RNA,采用RT-PCR技术首次扩增出Tm7基因的全序列,该基因的开放阅读框为207 bp,编码68个氨基酸.将此基因克隆到pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a-Tm7,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物.以纯化后的表达蛋白作为抗原,建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白间接ELISA方法.研究结果表明,Tm7基因在大肠杆菌中成功表达,表达产物为约27 ku的融合表达蛋白,该蛋白能识别羊脑多头蚴病阳性血清.建立的间接ELISA方法,检测敏感性可达93.3％,特异性达94.1％,研究结果表明Tm7重组蛋白可作为脑多头蚴病的诊断抗原.     

猪带绦虫六钩抗原基因的克隆与表达

以λｇｔ１１为载体构建了猪带绦虫钩蚴ｃＤＮＡ文库，从中筛选出５株表达六钩蚴抗原成分的重组噬菌体。将其中的六钩蚴ｃＤＮＡ与表达质粒ＰＧＥＸ－４Ｔ２连接，在ＴＧ１大肠杆菌中高效表达，获得了２株表达ＧＳＴ－六钩蚴抗原融合蛋白（Ｍｒ分别为５×１０＾４和６×１０＾４）的工程菌。在ＬＢ营养液中添加１％乳糖和０．２％葡萄糖，工程菌的表达效果优于用ＩＰＴＧ诱导的效果。融合约占工程菌总蛋白２３％。     

链球菌GapC蛋白的表达及其多克隆抗血清的制备

本研究对乳房链球菌GapC蛋白基因进行了克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性试验。应用PCR技术直接从临床分离的乳房链球菌菌株基因组中扩增出GapC蛋白基因,并将其克隆至pET28a（＋）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）中表达。经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的乳房链球菌GapC基因序列AF421900的同源性为99．8％。氨基酸同源性为100％;与GenBank发表的无乳链球菌GapC基因序列AF421899的同源性为91．4％;与停乳链球菌GapC基因序列AF375662的同源性为88．9％。表达的融合蛋白通过MagneHis^TM蛋白纯化试剂盒纯化,纯化蛋白免疫小鼠3次,制备GapC抗血清。本研究表达和纯化了乳房链球菌GapC蛋白,并制备出鼠抗血清,为下一步开展GapC重组蛋白的应用研究莫定了基础。     

猪带绦虫六钩蚴免疫原基因的克隆、表达与结构预测

从猪带绦虫六钩蚴cDNA表达文库中筛选、克隆的Ts01基因，设计表达性引物，亚克隆到pGEX-4T-1表达载体，构建了pGEX-GST-Ts01的融合表达重组载体，转化BL21寄主菌和IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE和Western蛋白分析．表明成功地高效表达了约40000右的融合蛋白质．与预测的相对分子质量大小一致，表达量达40％左右。表达产物具有免疫学活性，而且呈可溶性，未形成包涵体，这与用蛋白质软件分析的Ts01编码蛋白水溶性相一致。     

狂犬病病毒核蛋白基因的克隆序列分析及其在E.coli中的高效表达

对狂犬病病毒（RV）ERA株核蛋白（N）基因进行了克隆和序列分析。根据GenBank中已发表的RVN基因序列，设计合成了1对特异性引物，对RV ERA株N基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18T连接得到重组质粒pMD-N，并进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1353bp，编码450个氨基酸。RV ERA株与CVS-11、PV-11、SRV9和SAD—B19株相比，核苷酸的同源性分别为98％、98．3％、99％、99.6％，推导的氨基酸的同源性分别为98％、99％、99％、99.6％。将pMD-N双酶切，回收目的基因片段并克隆到原核表达载体pET28a（＋）中，构建了重组质粒pETN；将其转化表达菌BL21（DE3）并用IPTG进行诱导表达。结果重组菌裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为53kDa的重组蛋白。经凝胶薄层扫描分析，重组蛋白表达量占菌体蛋白的56．8％，Western-blot结果显示该重组蛋白能与RV多克隆抗体发生特异性反应。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。     

猪脑心肌炎病毒2A蛋白的原核表达与纯化

本试验对猪脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16 ℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

Comparison of 2 methods of centesis of the bursa of the biceps brachii tendon of horses

REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air.     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Effects of size of ingestively masticated fragments of plant tissues on kinetics of digestion of NDF

Ingestively masticated fragments were collected and sized via sieving. Different sizes of esophageal masticate and ruminal digesta fragments, and ground fragments of larger masticated pieces were incubated in vitro, and undigested NDF remaining at intervals of up to 168 h of incubation was determined. The ruminal age-dependent time delay (tau) for onset of digestion of NDF was positively correlated (P < 0.004) with the mean sieve aperture estimated to retain 50% of the fragments between successive sieve apertures (MRA). Degradation rate of potentially degradable NDF (PDF) and level of indigestible NDF were not related (P > 0.10) to MRA of masticated and ground fragments. Estimates of tau were positively related to MRA, with slopes of bermudagrass < corn silage < ruminal fragments of corn silage. It was concluded that fragment size-, and consequently, ruminal age-dependent onset of PDF degradation of a mixture of different fragment sizes results in an age-dependent rate of degradation of the more rapidly degrading of two subentities of PDF. Models are proposed that assume a tau before onset of simultaneous degradation of PDF from two pools characterized as having gamma-modeled age-dependency and age-constant rates. The ruminal age-dependent pool seems to be associated with the faster-degrading pool, and its rate parameter increases with range in MRA in the population of fragments. Conceptually, the ruminal age-dependent rate parameter for PDF degradation seems to represent a composite of several effects: 1) effects of the size-dependent tau; 2) range in MRA of the population of ingestively masticated fragments; and 3) subentities of PDF that degrade via more rapid age-dependent rates compared with subentities of PDF that degrade via age-constant rates. The estimated fractional rates of ruminative comminution of ingestively masticated fragments (0.060 to 0.075/h) were of a magnitude similar to the mean fractional rates of PDF digestion (0.030 to 0.085/h), which implies that ruminative comminution may be first-limiting to fractional rate of PDF digestion. The in vivo roles of ingestive and ruminative mastication of fragments on PDF degradation must be considered in any kinetic system for estimating PDF digestion in the rumen. These results and others in the literature suggest that the rate of surface area exposure rather than intrinsic chemical attributes of PDF may be first-limiting to degradation rate of PDF in vivo.