鸵鸟HSN1亚型高致病性禽流感病毒的分离与鉴定

从某鸵鸟场病死鸵鸟的脑和脾中分离到1株禽流感病毒。其血凝价为6l0g2。血清学试验结果表明其血清型为H5N1。致病性试验结果表明该分离株对鸡表现为高致病性。电镜观察结果显示．该病毒为典型的禽流感病毒粒子。利用RT—PCR扩增出了与预期片段相同的特异性型扩增产物．大小约为900个碱基。该病毒株暂命名为：A／ostrich／HeNan／14／2002(H5N1)(简称HN／2002)。     

野鸟源H5N8禽流感病毒遗传变异分析与致病性评估

本试验在野鸟禽流感病毒紧急疫情检测过程中鉴定并分离到1株H5N8高致病性禽流感病毒,利用病毒全基因组测序、系统发育及关键氨基酸位点分析解析了该野鸟源H5N8禽流感病毒分离株遗传进化情况,通过体外复制动力学试验及小鼠感染试验,评价了该野鸟源H5N8禽流感病毒分离株对哺乳动物致病性。进化分析显示,该病毒株属于Clade 2.3.4.4,可以不经适应直接感染小鼠并在呼吸系统内复制,表现出有限的组织嗜性,对小鼠呈低致病性。其在体内外复制能力较低。结果表明,本试验加深了对野生鸟携带H5N8禽流感病毒的认识和理解、对野鸟源H5N8禽流感病毒生物学特性的评价,为预测野鸟源H5N8禽流感病毒遗传进化趋势及其生物安全风险评估提供借鉴和参考。     

一株天鹅源H5N1亚型禽流感病毒的分离鉴定

2004年从广东某地送检的病死天鹅肺组织中分离到1株禽流感病毒,用血凝抑制试验(HI)、聚合酶链反应(PCR)、基因测序等对其进行了亚型鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且H5亚型禽流感病毒标准阳性血清能对其产生特异性抑制作用;分别用针对禽流感病毒M基因、H5亚型禽流感病毒HA基因、N1亚型禽流感病毒NA基因特异性引物对该分离株进行PCR扩增,均获得特异性目的片段;测序及BLAST分析表明HA基因与A/chicken/Viet Nam/Ncvd8/2003(H5N1)的HA基因同源性为98%;NA基因与A/swine/Fujian/1/2003(H5N1)的NA基因同源性为98%,由此该分离株鉴定为H5N1亚型禽流感病毒,按照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为A/Swan/Guangdong/197/2004。     

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒的分离鉴定

在广东进行流行病学调查时从鹦鹉采集的拭子样本中分离到一株禽流感病毒,应用聚合酶链反应(PCR)、血凝抑制试验(HI)和基因测序等方法技术对其进行了亚型鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且被H5亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制;分别用针对禽流感病毒的M、H5亚型禽流感病毒的HA基因、N2亚型禽流感病毒的NA基因特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,均扩增出特异性目的片段;测序及BLAST分析表明其与H5N2亚型禽流感美国分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性高达97%以上,由此该分离株鉴定为H5N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Parrot/Guangdong/268/2005。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒对鸽的致病性分析

为评估H5N1亚型禽流感病毒对鸽的致病性,用我国2004年分离的一株H5NI亚型禽流感病毒A/pigeon/GD/C2/2004( H5NI)人工感染4周龄鸽,进行了致病性试验.结果表明,该株病毒以106EID50/I00μL剂量感染能致死鸽,致死率为22.2％,病毒能在感染鸽体内广泛分布,其中肺脏和肾脏中病毒含量达到...     

鸭源H5N1亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及其HA和NA基因的生物信息分析

分离到1株 H5N1亚型高致病性禽流感病毒, 经序列测定发现HA蛋白裂解位点上插入多个连续的碱性氨基酸（PQREIRRKKR*G）,从分子上证实是一株高致病性禽流感病毒。核酸序列比较分析结果表明,分离的流感病毒HA基因与A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1)同源率最高,达到98.8%;NA基因与A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1) 和A/chicken/Jiangsu/cz1/2002(H5N1)同源率最高,达到98.7%。氨基酸水平上,HA与A/duck/Viet Nam/Ncvd1/2002(H5N1)同源率最高,可达99.3%;NA与A/chicken/Jiangsu/cz1/2002(H5N1)同源率最高,达98.7%。HA与NA基因的潜在糖基化位点与作者所选参比毒株一致。通过遗传进化树分析结果表明,A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1)可能是该毒株的来源株。     

一株鸭源H5N2禽流感病毒全基因组序列分析及对鸡的致病性研究

2012年在我国重庆市活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到1株H5N2亚型禽流感病毒(AIV),DK/CQ036/12(H5N2).为了解该株H5N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行了全基因组分析及对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验.序列分析显示:HA裂解位点序列为341R-----346TRGLF350,为低致病性AIV特征.内部基因来源较复杂,与KD/CQ/036/12分离株的M基因NP基因同源性最高的病毒株均来自H4、H7等亚型分离株,呈明显的异源性.分离株的感染性试验显示,该分离株在鸡体内可以通过呼吸道和消化道向外排毒,但并不能在鸡体内有效的复制.对小鼠的感染性试验结果显示,仅在鼻甲和肺能检测到病毒存在,其他脏器病毒滴定结果为阴性,表明病毒对鸡和小鼠均呈低致病性.     

H6亚型鸭源流感病毒HA基因序列分析

为了研究H6亚型禽流感病毒的分子特征,本研究从鸭的咽喉拭子样本中分离到一株禽流感病毒,通过血凝抑制试验证实该分离株为H6亚型流感病毒,命名为A/duck/Heilongjiang/QG 1/2013(H6).对其血凝素基因进行了克隆和序列分析,结果表明分离株与我国鸭源禽流感病毒A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的同源性最高,达到97.8％.系统发育树分析进一步证实分离株与A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的亲缘关系最近,共同起源于台湾分离株A/chicken/Taiwan/G23/87 (H6N1).本研究为H6亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据.     

一株普通鵟源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从深圳野生鸟类救护基地的1只普通鵟的泄殖腔拭子中分离到1株禽流感病毒,将该禽流感病毒进行鸡胚接种和HA、HI试验鉴定、HA基因扩增及测序分析,并进行致病性试验。结果表明,该分离株为H9N2亚型禽流感病毒,按照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为A/Wild bird/Guangdong/SZ-YN05/2015(H9N2)。进化分析显示,该毒株属于4.2.1分支,与SS/94株同源性较低,与A/Chicken/Shandong/GM-TH/2014(H9N2)的遗传距离最近。同时以血凝价HA 8log2病毒尿囊液稀释200倍静脉注射接种感染4周SPF鸡,感染3d后从心、肝、肺、肾、气管、咽及肛分别检测到病毒,感染7d后从心、肝、肺、肾、气管均未分离到病毒,咽部病毒分离率2/6,肛部病毒分离率3/6。     

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒（AIV）在广西中越边境地区的流行情况，本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒，命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6），对其HA和NA基因进行序列测定，并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示，分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012（H1N2）的核苷酸同源性最高（96.9%），NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016（H5N6）的核苷酸同源性最高（98.2%）。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF，符合低致病性禽流感病毒分子特征；与部分N6亚型禽流感病毒一样，分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外，本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定，结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2，3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6）是一株重组低致病性禽流感病毒。     

水禽用H5亚型禽流感灭活疫苗对高致病性禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果研究

为评价水禽用禽流感灭活疫苗(H5N2亚型,D7株)对2010年以后分离的高致病性禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果,将该疫苗免疫3周龄SPF鸭后,21 d采血、分离血清测定HI抗体效价,同时用5株2010年以后分离的高致病性禽流感流行毒进行攻毒保护试验,攻毒后5d采集所有试验鸭喉头和泄殖腔拭子进行病毒分离.结果显示,该疫苗免疫SPF鸭21 d后的HI抗体效价的几何平均滴度达7.4log2,对5株高致病性禽流感病毒的攻击均可产生良好的免疫保护,并有效阻止病毒排泄.该疫苗的推广使用将对我国水禽高致病性禽流感的防控发挥重要作用.     

两株H6N2亚型鸡源禽流感病毒的分离鉴定

本研究利用血凝抑制试验(HI)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因测序等方法,对广东省某活禽交易市场进行流行病学调查时获得的两株非H5、H9亚型禽流感病毒65株和C7株进行了亚型鉴定。结果表明这两株病毒均具有血凝活性,且能被抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制。用针对禽流感病毒的M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因特异性鉴定引物对65株和C7株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段。测序及BLAST分析表明两株分离株与H6N2亚型禽流感广东分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性均高达95%以上。将该两分离株鉴定为H6N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009、A/Chicken/Guangdong/C7/2009。     

湖南省洞庭湖区5株H6N6亚型禽流感毒株HA、NA基因的遗传进化分析

为了从分子生物学角度了解H6N6亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律,为该地区H6N6亚型禽流感的防控提供一些理论依据,对2012年在洞庭湖区分离的H6N6亚型禽流感毒株的HA、NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本试验分离到的5株H6N6亚型禽流感毒株HA裂解位点为PQIETR↓GLF,均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒;5株病毒的HA和NA潜在的糖基化位点有一些差别,这些差别是否会引起其毒力和致病力上的差异还有待研究;从基因遗传进化关系来看,这些毒株与我国汕头、广西分离的毒株同源性较高。     

禽流感变异株诊断抗原的特异性和敏感性试验

禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类感染或疾病的综合征,被国际兽疫局(OIE)确立为必报传染病,我国也列为一类动物疫病,禽流感亚型中以H5N1的危害最为严重.禽流感病毒容易变异,2006年2月国家参考实验室从山西省阳泉市分离到1株H5N1亚型高致病性禽流感病毒(CK/SX/06),该病毒与我国1996年从广东鹅分离株的HA基因同源性只有90%左右,并且在抗原性上有较大差距(64倍),H5N1和H5N2商品疫苗(哈尔滨维科公司)对该病毒株的攻击保护率仅为83.3%.     

H9N2亚型禽流感病毒TJ1株的分离与鉴定

从发病蛋鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒TJ1株,对其进行了系统的生物学特性鉴定.结果表明,分离毒TJ1株具有血凝性,且凝集不被新城疫和产蛋下降综合征抗血清抑制,而被H9亚型禽流感病毒标准阳性血清抑制,禽流感琼扩试验结果为阳性,在电镜下呈典型的流感病毒粒子形态,证明该毒株为A型流感病毒;通过致病力试验,分离毒TJ1株对6周龄SPF鸡无致病性,为低致病性毒株;用其制备成油乳剂灭活疫苗免疫雏鸡,能很快产生对H9特异的血凝抑制抗体,于免疫后3周攻毒,可以保护雏鸡抵御同病毒攻击的感染,表明分离毒TJ1株具有良好的免疫原性.     

1株重组的H5N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

本研究对1株H5N2亚型禽流感病毒(CK/GD02/14)进行全基因测序及遗传进化分析,结果显示,该病毒HA蛋白裂解位点含有多个连续的碱性氨基酸(321PQIEGRRRKR*GLF333),为高致病性禽流感病毒特征。遗传进化分析结果显示,CK/GD02/14与A/chicken/Jiangsu/1001/2013(H5N2)各基因片段都有较高的同源性(97.6%~98.9%)。HA基因位于H5N1亚型遗传进化树的7.2分支,NA基因属于H9N2亚型遗传进化树的BJ/1/94-like分支。其内部基因与1株H9N2亚型病毒的内部基因有较高的同源性,但其M基因属于类H5N1病毒分支,表明该H5N2亚型禽流感病毒为H9N2和H5N1亚型禽流感病毒的重组毒株。结果表明,CK/GD02/14与A/chicken/Jiangsu/1001/2013(H5N2)为同源毒株,可能由江苏传到广东地区。     

禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/72420/96(LPAI-H5N2)株HA全基因克隆与序列分析

为进一步分析禽流感病毒(AIV)H5N2分离株血凝素(HA)基因的特性,参照已发表H5亚型禽流感HA基因序列设计了1对引物,采用RT-PCR技术,以禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/72420/96(D96)RNA为模板,扩增了HA全基因并进行核苷酸同源性比较,氨基酸编码分析,绘制系统发育进化树。结果表明,扩增片段长1737个核苷酸,包含了完整的HA基因的开放阅读框架,与Genbank已发表的H5N1和H5N2分离株的HA基因序列比较,发现与国内H5N1分离株同源性较低,只有80%左右,而与H5N2各株序列具有很高的同源性,最高达97.5%,印证了AIV基因组8个片段间频繁的重组及AIV高变异性的特点。推导的氨基酸序列分析表明,HA蛋白裂解位点上游丢失了4个连续碱性氨基酸(R-R-R-K),裂解位点处氨基酸序列为E-T-R,仅包含一个碱性氨基酸(R-)残基,符合低致病性毒株的特征,证明为低致病性毒株。其HA推导后氨基酸序列与H5N1AIV的同源性接近90%,以其研究的疫苗,可以有效抵御我国流行的H5亚型AIV病毒的感染,同时因为是弱毒株,以其研制的疫苗具有更好的安全性,也更符合公共卫生学的要求。     

一株H10N7亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

2013年,从秦皇岛野鸟林鹬体内分离到一株H10N7亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/Wood Sandpiper/Qinhuangdao/660-662/2013(H10N7)[简称WSP/QHD/660-662/2013(H10N7)]。本研究对该分离株的全基因序列进行测定,并对其进行致病性研究。基因组序列分析表明:该病毒的HA蛋白裂解位点为334PELMQGRGL343,属于低致病性AIV的分子特征,其HA基因与A/Duck/Hunan/S11205/2012(H10N3)的相似性达到97.90%,NA基因与A/Domestic Duck/Republic of Georgia/1/2010(H10N7)的相似性达到97.46%,内部基因与H9N2等多亚型AIV的相应基因节段具有较高的相似性,推测该分离株可能为一株多亚型流感病毒的重组株。对动物致病性试验结果显示:该病毒可以感染哺乳动物模型BALB/c小鼠,并且仅能够在鼠的肺脏和鼻甲骨粘膜上皮细胞中复制,表明该病毒分离株对小鼠也呈现低致病性。     

一株H11N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解禽流感病毒在华东地区家禽体内的进化情况,作者对华东地区某活禽市场的家禽进行了禽流感病毒的流行病学监测,并分离鉴定出1株H11N2亚型禽流感病毒A/duck/Jiangxi/k0701/2009。对该株病毒全基因组的遗传进化分析表明A/duck/Jiangxi/k0701/2009的8个基因片段来源广泛,与亚洲及欧洲某些地区的毒株存在广泛的重组现象。其PB2基因和NS基因可能由A/mallard/Korea/GH170/2007(H7N7)提供,NA基因与高致病性禽流感病毒A/duck/Hebei/0710/2009(H5N2)的NA基因亲缘关系较近,而PB1、PA和NP基因则可能与A/Muscovy duck/Thailand/CU-LM1984/2009(H4N9)有共同来源。本研究结果提示该株病毒可能为1株多元重组病毒,且可能在高致病性禽流感病毒的进化中起了重要作用。     

一株鸭源H3N6亚型禽流感病毒遗传进化分析

从活禽交易市场健康鸭体内分离到一株H3N6亚型禽流感病毒,命名为A/Duck/Guangdong/E9/2012(H3N6),这是该亚型禽流感病毒在我国广东地区的首次分离报道.为分析其遗传进化特征,对该病毒全基因组序列进行了测定,进行了遗传进化分析.结果显示,其HA裂解位点附近的氨基酸序列为PEKQTR↓ GLF,只含有1个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点氨基酸序列的分子特征;其HA基因与2011年蒙古国分离的鸭源A/Duck/Mongolia/OIE-7457/2011(H3N5)禽流感病毒的HA基因同源性最高,其NA基因与2011年蒙古国分离的鸭源A/Duck/Mongolia/OIE-7438/2011(H4N6)禽流感病毒的NA基因同源性最高.全基因组分子遗传进化分析结果显示,其8个基因均属于欧亚谱系的禽源进化分支.