龙眼转醛醇酶基因的克隆与原核表达

转醛醇酶作为磷酸戊糖途径非氧化阶段的关键酶,在调节植物PPP对环境胁迫的应答中起重要作用.该研究应用RACE方法克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)花芽中转醛醇酶的基因,获得一段长度为1 655 bp的cDNA,其中包括一个1 320 bp的开放阅读框,已登陆GenBank,登陆号为FJ472991(GI:217795375).将转醛醇酶全长cDNA在大肠杆菌中表达,获得一个约55 kD带有组氨酸标签的外源蛋白.RT-PCR结果显示,TAL mRNA在龙眼成花逆转花芽中有较明显的表达量上调,说明TAL在一定程度上影响了龙眼正常成花.     

龙眼胚胎F3H基因的cDNA克隆及序列分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对‘立冬本'龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分离,通过MALDI-TOF-TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮-3-羟化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F3H)。以‘立冬本’龙眼胚胎cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得F3H基因cDNA 1 404 bp全长序列。序列分析表明,F3H基因共编码365个氨基酸,其cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等F3H基因的同源性均高达80%以上,该基因在GenBank中登录号为EF468104。     

芜菁Br14-3-3的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆了‘津田芜菁’（Brassica rapa subsp. rapifera‘Tsuda’）通用调节因子14-3-3基因cDNA序列，命名为Br14-3-3（GenBank登录号为MK896872）。该基因全长1 113 bp，开放阅读框全长774 bp，编码含有257个氨基酸的多肽。荧光定量PCR分析Br14-3-3在‘津田芜菁’不同组织中及其在温度、脱水、渗透、ABA和无机盐等非生物胁迫下幼苗中的表达，结果表明该基因在‘津田芜菁’的花中表达量最高，幼苗中次之；低温抑制了Br14-3-3的表达，其他非生物胁迫可诱导该基因表达，暗示Br14-3-3在非生物胁迫应答中发挥功能。     

龙眼亚硫酸盐氧化酶(DlSO)基因的克隆及表达分析

【目的】探讨龙眼果实亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO)在硫残留生物降解中的作用。【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得龙眼亚硫酸盐氧化酶基因全长cDNA序列,命名为DlSO;运用荧光定量PCR对其表达量进行分析;使用ClontechIn-Fusion技术构建原核表达载体,使其在Rosetta(DE3)大肠杆菌中表达。【结果】DlSO序列全长1413bp,包含一个1182bp的开放阅读框,一个长37bp的5’非翻译区序列和194bp的3’非翻译区,预测编码393个氨基酸;同源性和系统进化分析结果均表明DlSO与毛果杨SO亲缘关系最近;荧光定量结果表明,在龙眼不同组织中,DlSO基因都有表达,其中在叶片中表达量最高,其次是花、幼果、根和果肉,在茎和果皮组织中DlSO基因的表达量最低;成功构建pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导后在Rosetta(DE3)大肠杆菌中成功表达。【结论】克隆了龙眼亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO),并且成功构建了pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达出融合蛋白,为下一步研究龙眼亚硫酸盐氧化酶的作用奠定了基础。     

龙眼梅PGIP基因的克隆及序列分析

利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在龙眼梅(PrunusmumeSiebetZucc.Longyan)嫩芽中特异性表达的PGIP基因。DNA序列分析表明,所获得龙眼梅的PGIPcDNA的序列全长为1045bp,该序列与已发表的PGIP基因有很高的同源性。     

茶树CsMAPK3的全长克隆及其逆境表达分析

以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆了CsMAPK3的全长cDNA序列(GenBank登录号:MF034662)、基因组序列及其启动子序列。CsMAPK3的cDNA序列全长1700 bp,含有1119 bp的ORF序列,编码373个氨基酸;CsMAPK3蛋白预测为亲水性蛋白,含有多个磷酸化位点;多序列比对和进化树分析表明CsMAPK3 C–末端含有保守的CD结构域,属于TEY类型的A亚家族MAPK;亚细胞定位预测CsMAPK3主要定位于细胞质和细胞核中。CsMAPK3基因组全长4930 bp,包含5个内含子和6个外显子,第1个内含子和第2个内含子较大,分别为1608和1318 bp,外显子长度在130~350 bp之间。克隆获得起始密码子上游1125 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。荧光定量表达分析显示,ABA、低温和盐胁迫均能显著上调茶树叶片中CsMAPK3的表达。蛋白互作预测表明CsMAPK3可能与MYBR1互作来响应ABA依赖途径的非生物胁迫过程。综上表明,CsMAPK3可能与茶树抗逆响应密切相关。     

糙皮侧耳蓝光受体基因Pcry的克隆及分析

采用快速获得基因末端法(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)克隆出糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)蓝光受体基因Pcry的全长cDNA序列。该cDNA全长1725 bp,含有一个1572 bp的开放阅读框,共编码523个氨基酸。表达模式分析显示该基因在子实体期表达量最高,菌丝期最低。该基因在蓝光照射后的菌丝中表达量最强,在黑暗培养的菌丝中表达量最弱。蓝光刺激可以增加该基因转录量。生物信息学分析发现其编码的蛋白是一种光信号蛋白,目的蛋白分子量为57.44 kDa,等电点为4.90,且该蛋白具有信号转导、调控其它基因转录的功能。     

砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

桦褐孔菌纤维素酶基因的克隆与原核表达

成功获得了桦褐孔菌(Inonotus obliquus)JL 01菌株的内切葡聚糖酶(IO-EG)和β-葡萄糖苷酶(IO-BGL)的cDNA全长序列.eg2基因cDNA序列全长(ORF)为1149 bp,编码382个氨基酸,bgl2基因cDNA序列全长(ORF)为2583 bp,编码860个氨基酸;成功构建了30a-eg2和30a-bgl2大肠杆菌表达菌株,诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析表明两个菌株均表达蛋白,且蛋白以包涵体形式存在,为桦褐孔菌高效外源基因表达系统的建立提供了基础.     

青花菜快速碱化因子RAL F 的克隆与序列分析

 以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段序列为信息探针, 在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索, 经人工拼接、RT - PCR克隆与序列分析验证, 获得了青花菜快速碱化因子RALF(Rapid Alkalinization Factors) 基因的cDNA全长序列, 命名为BoRALFL1 (GenBank序列登录号DQ059310)。该cDNA全长240 bp, 编码79个氨基酸, 与电子克隆获得的序列完全相同。序列分析表明, 编码蛋白存在前导信号肽与多个磷酸化位点, 与同源基因RALFL8核酸序列在88 bp上有82%的一致性, 推导的氨基酸序列在74个氨基酸上存在56%的一致性, 不同植物间氨基酸序列N - 端差异大, C - 端具有较高的保守性。     

黄瓜果实弯曲相关基因Cs14-3-3 的克隆及表达分析

 以黄瓜（Cucumis sativus L.）果实易发生弯曲的品种‘长春密刺’为试验材料,采用RT-PCR 技术从果皮中分离并克隆了14-3-3 蛋白基因,并将此基因命名为Cs14-3-3。Cs14-3-3 基因cDNA 全 长792 bp,编码263 个氨基酸,分子量29 589.287 Da,等电点为4.585。生物信息学分析表明此基因含有 14-3-3 蛋白基因的典型结构域,与其他物种14-3-3 蛋白基因核苷酸序列同源性达到75%以上,编码的氨 基酸序列同源性达到85%以上,属于14-3-3 蛋白基因家族。同时,采用实时荧光定量PCR 方法对顺直果 实和弯曲果实腹部及脊部在果实开花的2、4、6、8、10、12 d 的基因表达量进行了研究。结果显示,在 果实发育各个时期,Cs14-3-3 的表达量均为在弯曲果实腹部 > 顺直果实 > 弯曲果实脊部的表达量;在 各个部位,Cs14-3-3 在果实开花2 d 的表达量明显高于开花后其他时期。试验结果表明,Cs14-3-3 基因为 黄瓜果实弯曲相关基因,在黄瓜果实开花早期发育过程中起重要作用。     

苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性

 根据已报道的植物铁结合蛋白基因( ferritin) 的保守区域设计引物, 用RT2PCR 的方法从‘嘎拉’苹果叶片中获得铁结合蛋白基因的全长序列。该基因cDNA共有1 043个碱基, 其中编码区834bp, 编码277个氨基酸残基的蛋白质, 终止密码子后有209 bp左右的3’端尾随序列区。Southern杂交结果显示ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5 mmol·L ^{- 1}的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗不同时间后的定量RT-PCR分析表明, ‘嘎拉’苹果的铁结合蛋白基因随着诱导时间的延长表达量增加, 说明该基因可能在转录水平上受铁诱导表达。     

白菜多聚半乳糖醛酸酶基因B cM F6的克隆、序列分析及其表达

 从白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino) 核隐性不育两用系‘Bajh97201A /B’可育株中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段入手, 利用RACE技术成功克隆了一个花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶( PG) 基因BcMF6的DNA和cDNA全长序列, 并对其序列进行了分析。结果表明, 该基因包含4个外显子和3个内含子, 最大开放阅读框为1 194 bp, 编码397个氨基酸序列, 对推导的氨基酸序列进行分析, 1到22个氨基酸是1信号肽序列, 其后有4个平行β螺旋重复( PbH1) 结构, 该序列包含3个N -糖基化位点, 4个蛋白激酶c磷酸化位点, 5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点, 10个N - 豆蔻酰化位点, 1个PG活性位点(²²⁷RVTCGPGHGIS1 IGS²⁴⁰ ) 等。将B cM F6基因氨基酸序列与数据库中的其他PGs基因进行同源序列比对, 构建系统进化树, 发现该基因具有所有PGs基因特有的4个保守结构域, 并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类, 表明该基因是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因。RT-PCR对其表达的研究表明, 该基因在可育株(野生型) 的中大蕾、开放花和短角果中特异表达, 进一步表明该多聚半乳糖醛酸酶基因与白菜的花粉发育相关。     

甜椒甘油- 3 - 磷酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析

 用RT-PCR技术从甜椒(Capsicum annuum ) 中克隆了甘油- 3 - 磷酸酰基转移酶基因的cDNA序列, 其全长为1 791 bp, 开放阅读框架为1 392 bp, 编码463个氨基酸, 命名为CaGPAT。序列分析表明该基因与番茄中的甘油- 3 - 磷酸酰基转移酶基因同源性最高; 在进化上与番茄最先聚类, 其次是菠菜。Northern杂交结果显示, CaGPAT在甜椒各器官中表达量差异较大, 叶片中的表达量明显高于根、茎、花及果实。低温诱导该基因快速表达, 8℃下处理3 h该基因表达量最高, 12 h以后基因表达量下降; 而高温对基因表达没有明显影响。当温度低于15℃时基因表达被诱导。结果表明甜椒叶绿体CaGPAT的表达量与低温关系密切。     

马铃薯C-8,7甾醇异构酶基因(StSI1) cDNA克隆及表达

 以拟南芥C-8, 7甾醇异构酶的氨基酸序列为信息探针搜索GenBank数据库, 对高度同源的马铃薯EST序列进行拼接、引物设计和RT2PCR扩增, 扩增产物测序结果证实获得一个马铃薯C-8, 7甾醇异构酶基因(StSI1) 的全长cDNA序列。序列分析结果显示, StSI1全长886 bp, 包含59 bp的5′非编码序列、161 bp的3′非编码序列和一个长度为666 bp编码221个氨基酸的开放阅读框, 分子量约为25 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白的N端含有一个长度由35个氨基酸残基组成的信号肽, C端成熟肽区域含有典型的类EBP结合域。氨基酸比对分析表明, StSI1与已知C-8,7甾醇异构酶同源性介于32.9% ～61.3%之间, 与拟南芥AtSI1相似性最(61.3% ) 。RT-PCR 表达谱分析显示, StSI1在马铃薯的块茎芽眼和表皮组织中均能表达, 并且该基因的表达水平受贮藏温度升高和光照增强的正向调节。     

14-3-3σ regulates p27 and inhibits Rat1-Akt cell proliferation

AIM: The present study was designed to investigate the effect of adenovirus-mediated 14-3-3σ on the proliferation of Rat1-Akt cells and to explore whether this effect is completed regulating p27.METHODS: The effect of Ad-14-3-3σ gene transfection on Rat1-Akt cell proliferation was observed by using 5-bromodeoxyuridine (BrdU).Then immunofluorescence and kinase assay were used to detect the effect of Ad-14-3-3σ on the phosphorylated level and intracellular location of p27.RESULTS: Ad-14-3-3σ-infected cells had fewer BrdU-positive cells (45%) than control (which was set at 100%).However,Ad-β-gal-infected cells had a high percentage of BrdU-positive cells (98%).14-3-3σ gene transfection downregulated phosphorylation level of p27 and decreased Akt-mediated intracellular location of p27.CONCLUSION: Transfection of 14-3-3σ gene suppresses the proliferation of Akt overexpession cell line Rat1-Akt.14-3-3σ decreases phosphorylation of p27 by downregulating Akt kinase,blocks Akt-mediated cytoplasm dislocation of p27,and inhibits proliferation of Rat1-Akt cells.     

斑玉蕈甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是糖酵解和卡尔文循环中的关键酶,本实验室之前的研究发现斑玉蕈菌丝的GAPDH表达随培养基中葡萄糖添加浓度的变化而变化,在此基础上我们首次克隆了斑玉蕈GAPDH的DNA和cDNA序列,结果斑玉蕈gpd基因长2 724 bp,对比基因组DNA和cDNA序列知其中有7个内含子、8个外显子;其理论分子量为36.15 kD、编码蛋白质含338个氨基酸、等电点(PI)为8.24。     

石蒜黄烷酮3–羟化酶基因LrF3H 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR 和RACE 技术相结合的方法,从石蒜花瓣中克隆到1 个黄烷酮3–羟化酶（F3H） 基因的cDNA 全长序列,全长1 293 bp,包含1 098 bp 的完整开放阅读框,编码365 个氨基酸;氨基酸序 列比对显示该序列编码的氨基酸与水仙的F3H 具有高达91%的同源性,将其命名为LrF3H。二级结构预 测表明,随机卷曲是LrF3H 蛋白最大量的结构元件,而α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。保守结构 域预测表明该基因编码的蛋白具有典型的F3H 蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2–O–酮 戊二酸结合位点,属于2OG-FeⅡ_Oxy 双加氧酶超家族。实时荧光定量PCR 分析表明,LrF3H 在整个花 发育过程中均表达,而且从初蕾期到盛开期随着花瓣着色加深表达量逐渐增加,盛开期表达量最高,之 后随着花朵萎蔫表达量下降;在不同器官中,LrF3H 的表达量在花瓣和花葶中最高,而在根、鳞茎和叶 片中都很低,推测该基因在石蒜花色形成过程中起着关键作用。