山羊乳腺上皮细胞重编程过程中细胞上清液外泌体不同提取方法的比较

为了比较不同方法提取山羊乳腺上皮细胞重编程过程中细胞上清液外泌体的效果，试验采用超速离心法和试剂盒法提取细胞上清液中的外泌体，利用透射电子显微镜观察外泌体形态，以纳米流式仪检测外泌体浓度和粒径，Western-blot法检测外泌体表面标志物蛋白并通过Image J软件分析其相对表达量。结果表明：超速离心法和试剂盒法提取的外泌体均具有圆盘状的双层膜结构，且轮廓清晰，但是试剂盒法提取的外泌体中存在其他蛋白质颗粒。超速离心法提取获得的外泌体较为分散，外泌体粒径集中在55～60 nm之间；试剂盒法提取获得的外泌体大小更为均一，外泌体粒径集中在58 nm左右。两种方法提取的外泌体表面特异性标志物CD63和TSG101蛋白均呈阳性。试剂盒法提取的外泌体浓度极显著高于超速离心法(P<0.01),提取的外泌体表面特异性标志物CD63和TSG101蛋白相对表达量也极显著高于超速离心法(P<0.01)。说明超速离心法和试剂盒法均可以从山羊乳腺上皮细胞重编程过程的细胞上清液中提取出外泌体，区别在于超速离心法提取的外泌体纯度更高，试剂盒法提取的外泌体浓度更高。     

金黄色葡萄球菌处理对奶牛乳腺上皮细胞外泌体表征的影响

【目的】本研究旨在从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus,以下简称金葡菌)处理奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cell,BMEC)上清中分离外泌体,探究金葡菌与BMEC数量比值(MOI)和处理后培养时间对外泌体总浓度的影响,并对金葡菌诱导BMEC释放的外泌体进行分离和鉴定。【方法】采用金葡菌临床分离菌株以MOI＝1和MOI＝10分别处理BMEC 3 h,对已处理的BMEC继续无外泌体培养9、12、24 h,同时设空白对照组,通过扫描电镜观察金葡菌处理对BMEC造成的超微结构损伤。采用超速离心法分离金葡菌诱导的BMEC上清液中的外泌体,分别用透射电镜、纳米颗粒追踪分析技术及Western blotting法对外泌体形态、颗粒大小和特异性标志蛋白进行分析鉴定。通过检测外泌体总蛋白浓度评估不同MOI和处理后培养时间对外泌体总量的影响,明确金葡菌诱导BMEC释放外泌体的最佳条件。【结果】通过扫描电镜观察发现,金葡菌处理BMEC后,细胞微绒毛脱落,细胞骨架破坏。透射电镜观察分离的外泌体为圆形的双层膜囊泡,直径在30~150 nm,形态均一。通过检测外泌体总蛋白浓度显示,在MOI＝10时,培养9、12和24 h金葡菌诱导BMEC释放外泌体蛋白浓度均高于MOI＝1,而培养12 h时释放外泌体蛋白浓度最高。对金葡菌诱导BMEC释放的外泌体进一步鉴定,其平均直径约为116 nm;Western blotting检测结果显示外泌体标记物CD9、CD81和TSG101表达阳性。【结论】本研究从形态学和分子生物学特征等方面证实获得的分离物为外泌体;金葡菌可以诱导BMEC释放外泌体,当MOI＝10时,金葡菌处理细胞3 h后继续无外泌体培养12 h,收获的细胞上清中外泌体蛋白含量最高。     

猪圆环病毒2型感染PK-15细胞中外泌体的鉴定及其对细胞增殖和凋亡的影响

旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子（CD81、TSG101）;PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30~200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显（P<0.01）,外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖（P<0.01或P<0.05）;PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。     

番鸭肝细胞外泌体miRNA表达谱的研究

为探究育雏阶段番鸭肝脏中外泌体携带miRNA的种类及其涉及的功能，试验采集3周龄雏番鸭肝脏制备原代肝细胞，培养3 d，离心取上清，试剂盒法分离肝细胞外泌体，电子显微镜观察外泌体形态和粒径，免疫印迹法检测外泌体CD81蛋白表达丰度。提取外泌体总RNA,miRNA测序后进行注释、GO和KEGG功能富集分析。结果显示：雏番鸭肝细胞外泌体为直径30～100 nm的囊泡小体，呈“杯托”状；标志性蛋白CD81免疫印迹结果呈阳性表达；miRNA测序共获得了59个新注释miRNA,GO功能富集结果主要涉及单有机体过程、刺激应答、多细胞有机体过程、定位、细胞器、胞外区绑定分子功能等；KGEE功能富集结果显示主要涉及淀粉和蔗糖代谢、MAPK信号通路、氨基糖和核苷酸糖代谢、肌醇磷酸代谢和磷脂酰肌醇信号传导系统等通路。研究表明番鸭肝脏外泌中的miRNA种类丰富，涉及多种生理功能。     

胚胎移植前供体牛与受体牛血浆外泌体miRNA差异表达分析

【目的】 探索胚胎移植前供体牛与受体牛血浆外泌体miRNA的表达差异, 以明确血浆外泌体miRNA在牛早期妊娠中的作用及其调控机制。【方法】 以3~6岁、体重480~600 kg的夏南牛作为研究对象, 选取10头供体牛进行同期发情、超数排卵和人工授精, 23头受体牛只做同期发情处理。在人工授精后第7天, 冲洗供体牛子宫以获取囊胚, 选取3头囊胚数相近的供体牛及3头与供体牛体重和年龄均相近的受体牛, 颈静脉采血, 进行血浆外泌体的分离与鉴定; 然后提取血浆外泌体miRNA, 并检测其表达量; 采用R语言中的DESeq差异算法计算P值, 并筛选出P<0.05的miRNA, 对差异表达的miRNA进行靶基因预测、GO功能富集分析和KEGG信号通路分析。【结果】 6个样本的囊泡粒径均在135 nm左右, 符合外泌体的特征。与供体牛相比, 受体牛中有9个miRNAs表达显著上调(P<0.05), 13个miRNAs显著下调(P<0.05);22个差异表达的miRNAs中, 有15个miRNAs预测出无重复的靶基因2 990个。GO功能富集分析和KEGG信号通路分析的结果表明, 这些靶基因主要富集在与生物黏附(biological adhesion)、定位(localization)、细胞连接(cell junction)功能有关的通路上, 显著富集的信号通路与黏着斑(focal adhesion)、黏着连接(adherens junction)有关, 提示血浆外泌体miRNA可能参与调控胚胎着床。【结论】 研究结果可为筛选和探究影响胚胎着床的血浆外泌体miRNA提供参考, 并为进一步阐明血浆外泌体miRNA在母牛早期妊娠调控中的作用提供依据。     

外泌体介导PCV2通过Toll7/8/9-MyD88-NF-κB信号通路诱导淋巴细胞分泌IL-10

以接种PCV2的PK-15细胞所分泌的外泌体(P-Exo)孵育的脾脏淋巴细胞为研究对象,采用Western blot、间接免疫荧光、ELISA和qPCR等方法,分析外泌体对脾脏淋巴细胞IL-10分泌的影响及其信号通路。结果显示,P-Exo呈杯状,平均直径为50~150 nm,表达标志蛋白CD81和TSG101,包含PCV2 Cap蛋白;P-Exo孵育淋巴细胞后在细胞浆内观察到Cap蛋白;与PCV2组相比,P-Exo组IL-10含量显著升高(P<0.05),P-Exo lysis组和P-Exo BAY组则无明显变化;与对照组相比,P-Exo组淋巴细胞Toll7、Toll8和Toll9 mRNA表达量极显著升高(P<0.01),Toll3 mRNA表达量显著升高(P<0.05),Toll2和Toll4 mRNA表达量无明显变化;P-Exo能够显著升高淋巴细胞胞浆MyD88和p-IκBα蛋白含量,降低胞浆NF-κB/p65的含量,促进NF-κB/p65入核。结果表明,PCV2通过外泌体感染淋巴细胞,激活Toll7/8/9-MyD88-NF-κB信号通路促进淋巴细胞分泌IL-10。     

鸽毛滴虫外泌体的分离鉴定及蛋白质谱分析

旨在研究鸽毛滴虫是否分泌外泌体及虫源外泌体的蛋白组成和功能,为探索外泌体在鸽毛滴虫寄生过程中的作用奠定基础。采集鸽毛滴虫感染个体口腔及咽部病灶处样本,进行分离培养及纯化,使用显微镜鉴定虫体形态,提取DNA并比对其序列,确定培养物是否为鸽毛滴虫虫株;通过对培养液上清进行超速离心,透射电子显微镜、Western blot技术和纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）鉴定培养液上清中是否含有虫源外泌体;最后通过Label-free技术分析虫源外泌体的蛋白质谱表达。结果显示,虫体具有明显的毛滴虫形态及特征,与鸽毛滴虫ITS1/5.8S/ITS2基因比对率达98%。从虫体培养液中提取的囊泡经透射电子显微镜观察具有明显的茶托样结构;NTA结果显示,粒径集中于125.1 nm,峰值粒径为132.3 nm,占比99.3%;CD63和TSG101等外泌体标记蛋白的条带明显,表明提取物为外泌体。质谱结果显示,烯醇酶、3-磷酸甘油醛-脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶和延伸因子为表达量较高的蛋白质。GO功能注释显示外泌体蛋白富集到细胞内和胞浆等细胞组分,发挥GTP连接和GTP酶活性功能,参与小GTPase介导的信号转导与糖酵解等过程。KEGG通路富集表明,虫源外泌体蛋白主要富集于代谢途径、糖酵解/糖异生、抗生素的生物合成和次级代谢产物的生物合成等通路。本研究发现鸽毛滴虫可以分泌外泌体,并对虫源外泌体进行蛋白质谱分析,提示虫源外泌体中的蛋白质在寄生虫的能量代谢、信号转导及生物合成等过程中发挥重要作用。     

两种提取细胞外泌体方法的比较

近期研究发现外泌体在很多生理病理过程中起着重要作用,因而外泌体已成为当前的科研热点。本研究从外泌体形态、标志蛋白的表达方面比较了He La细胞外泌体的两种常用提取方法,以期获得更有效地提取Hela细胞中的外泌体方法。利用电镜观察两种方法提取的外泌体形态;动态光散射(dynamic light scattering,DLS)测定外泌体颗粒大小及分布,蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测外泌体标志蛋白CD63、CD81的表达。结果显示,差速离心法与PEG沉淀法所提外泌体都呈茶托样双层膜结构,直径约30~150 nm,无明显形态差异,外泌体标志蛋白正常表达,但PEG沉淀法要引入PEG,有可能影响外泌体生物活性,可见,差速离心法是一种更可靠的有效提取外泌体的方法。     

囊性包虫原头蚴外泌体的提取及其特性的初步研究

笔者采用高速离心法,成功分离提取原头蚴分泌的外泌体(Protoscoleces Exosome,PE),电镜下观察到原头蚴外泌体为形状大小较为均一的球形颗粒,直径30 nm～200 nm,平均直径82 nm。SDS-PAGE分析,原头蚴外泌体蛋白主要集中分布在20 KD～43 KD之间。Western blot分析显示,包虫病患者血清在28.8 KD～35.5 KD之间可识别出3条明显外泌体蛋白条带。研究表明,高速离心法可有效分离原头蚴分泌的外泌体。外泌体蛋白成分具有较强的抗原性和免疫原性,具有作为包虫病诊断标志物或疫苗候选分子的价值。     

猪子宫腔液外泌体来源的TIMP2蛋白对胚胎附植的影响

旨在研究猪子宫腔液外泌体来源的TIMP2蛋白对妊娠早期胚胎附植的影响.本研究采用超速离心法分离妊娠第9天(n=3)和第12天(n=3)大白猪子宫腔液外泌体,利用Western blot(WB)检测外泌体中TIMP2蛋白的变化,并通过免疫组化试验研究TIMP2蛋白在子宫中的表达定位.进一步用外泌体与猪胚胎滋养层细胞(po...     

鸡胚外泌体miRNAs功能分析

旨在基于鸡胚外泌体及所含有的miRNAs解析其产生生理功效的活性物质基础及作用机制。本研究收集13胚龄惠阳胡须鸡胚蛋18枚（3组,每组6枚）,采用酶消化、蔗糖密度梯度和差速超速离心等方法分离鸡胚组织来源的外泌体,经透射电镜、纳米流式和标志蛋白流式检测等方法鉴定其特征。利用高通量测序方法研究外泌体样本中miRNAs表达谱,对各样本top 10且共表达的miRNAs进行靶基因预测与功能分析。结果表明,分别获得了3个浮力密度范围（S1：1.13 g·mL^-1、S2：1.21 g·mL^-1和S3：1.32 g·mL^-1）具有外泌体典型特征的胞外囊泡;与miRBase V21进行比对发现,S1、S2和S3样品中分别含有675、661和845个已知的miRNAs,这些miRNAs中有488个（52.6%）三者共有,包括了广泛参与细胞增殖、分化和免疫应答等过程的功能性miRNAs。TargetScan 7.2和miRDB预测得到3个样本中top 10且共表达的56个miRNAs的靶基因,获得的3 650个靶基因经DAVID分析,显著富集了24个与机体生长、发育、免疫等有关的生物学通路（P<0.05）,包括MAPK信号通路、mTOR信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路和GnRH信号通路等。本研究建立了鸡胚组织中有效分离外泌体的方法,发现鸡胚组织来源的外泌体miRNAs会影响机体生长发育和免疫调节有关的生物学通路。     

Cloning,Analysis and Construction of Eukaryotic Expression Vector of Buffalo MBD3 Gene

In this study,through cloning buffalo MBD3 gene and analyzing the biological information of MBD3 gene sequence,and constructing the expression vector of buffalo MBD3,to provide a basis for the function research of buffalo MBD3 gene on embryo development and iPCSs.The total RNA was extracted from buffalo fresh ovary,and MBD3 gene was amplified and sequenced,the sequence was systemically analysed with bioinformatics techniques.And the MBD3 CDS was cloned into the pEGFP-C1 vector.Then the recombinant plasmid pEGFP-C1-MBD3 was transferred into the HEK293T cells and buffalo fetal fibroblasts (BFF),the expression was analyzed by RT-PCR,Western blotting and fluorescence microscope.The results showed that 898 bp of MBD3 gene fragment including whole 774 bp CDS was cloned and sequenced,and encoded 257 amino acids.The multiple sequence alignment and analysis of phylogeny tree showed that MBD3 gene was highly conserved in the process of evolution.Especially the MBD domain,the MBD domain of buffalo MBD3 gene shared 100% of similar nucleotide sequence with Bos taurus,and shared 97% of similar nucleotide sequence with Homo sapiens,Sus scrofa and Pan troglodytes.The recombinant plasmids pEGFP-C1-MBD3 were transferred into HEK293T cells and BFF,fluorescence observation,RT-PCR and Western blotting were used to analyze the expression of buffalo MBD3.The results suggested that the expression vector of buffalo MBD3 gene was successfully constructed.The study laid the foundation for the function research of MBD3 on embryo development and inducing of iPCSs.     

水牛MBD3基因克隆分析及其真核表达载体的构建

本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞（iPSCs）中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到MBD3基因,测序并应用相关的生物学软件进行分析;将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,再将携带目的基因的重组质粒转染HEK293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞（BFF）,利用RT-PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明,克隆获得了898 bp的水牛MBD3基因序列,其中编码区全长774 bp,编码257个氨基酸。通过对MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析,MBD3基因在进化中高度保守,特别是MBD结构域,水牛与牛的同源性为100%,与人、猪、猩猩的同源性均为97%。将水牛MBD3基因真核表达载体转染HEK293T细胞和BFF,通过荧光观察、RT-PCR及Western blotting方法鉴定表明,成功构建了水牛MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的MBD3基因,并成功构建了MBD3基因的真核表达载体,为进一步研究MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。     

Prevalence and genotypic characterisation of Giardia in dairy calves from Western Australia and Western Canada

In this study, the prevalence of Giardia duodenalis infections was determined in Western Canadian and Western Australian dairy calves. Faecal samples were collected from Holstein calves located on a commercial dairy near Lethbridge, Alta., Canada (N=28) and from calves located on two commercial dairies located near Perth, WA, Australia (N=36). Faecal samples were examined for the presence of Giardia cysts using sucrose gradient centrifugation, followed by immunofluoresence microscopy. DNA was then extracted from Giardia isolates obtained from positive samples. A PCR based method was employed to amplify and sequence a 292bp region of the 16S-rRNA gene. Genetic sequences obtained from Giardia isolates were compared to each other and to previously sequenced isolates. Following a single faecal sample, 58% of Western Australian calves and 57% of Western Canadian calves were positive for Giardia. Geometric mean cyst counts/g of faeces were 839 for Western Australian calves and 3475 for Western Canadian calves, but these values did not differ significantly. Genetic sequences were obtained from 10 calves from Western Canada, while six sequences were obtained from Western Australian calves. Of the Western Canadian isolates, eight aligned with the proposed 'Hoofed livestock' genotype. Of the five isolates obtained from Western Australian calves, four sequences were identical to the 'Hoofed livestock' genotype. Two isolates from the Western Canadian calves and one isolate from the Western Australian calves had the identical genetic sequence to the Genotype (Assemblage) A sequence, a common human genotype. The results of this study demonstrate, for the first time, that Giardia infections occur in Western Australian calves. Also, calves from different geographical locations appear to be primarily infected with a Giardia genotype unique to hoofed livestock. However, calves can shed Giardia cysts potentially infective for humans. Thus, Giardia infections should be considered important to Australian dairy producers, and infections in calves may pose a risk to public health regardless of geographical location.