大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种“沉默”抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示：含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。     

变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建

以变铅青链霉菌TK24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(CDA)、放线紫红素(ACT)和十一烷基灵菌红素(RED)这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla,构建得到变铅青链霉菌菌株SBT5。将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入SBT5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株TK24只产微量蓝色抗生素;SBT5接合子的ACT产量也显著高于导入了额外act基因簇拷贝的出发菌株接合子。SBT5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选。     

灰红链霉菌AL7基因组文库及异源表达文库的构建

灰红链霉菌AL7对多种植物病原真菌和细菌都具有明显的抑菌活性。本研究在通用的大肠杆菌克隆宿主基础上,构建获得Dcm甲基化缺陷菌株,再引入接合转移辅助质粒pUZ8002得到菌株LP3。以LP3为宿主构建灰红链霉菌AL7的基因组粘粒文库,平均插入片段大小40kb。用高通量接合转移的方法将文库转到变铅青链霉菌TK24中,得到了异源表达文库,并从表达文库中初筛获得一些表型特异的克隆,如光秃表型、产素提前表型、产孢提前表型等。     

接合转移技术将外源DNA大片段引入变铅青链霉菌中的研究

为了发展一种将150 kb及以上的外源DNA片段引入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的有效方法,以大肠杆菌-变铅青链霉菌穿梭细菌人工染色体为载体,将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个150~180 kb的外源DNA片段期望以接合转移的方式从大肠杆菌宿主菌(Escherichia coli ET12567/p UZ8002)中横向转移入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK23菌株中。结果表明,接合转移技术能够有效地将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个外源DNA大片段引入到变铅青链霉菌基因组中并稳定传代。     

羊毛硫抗生素雷可肽同源基因簇的异源表达

高杰氏链霉菌中含有新型羊毛硫抗生素雷可肽(lexapeptide)的同源基因簇lxm2,为探索该基因簇相应的产物,将包含lxm2的细菌人工染色体转到变铅青链霉菌中进行异源表达,证实其可以产生雷可肽;同时还获得另一个新次级代谢产物,基因敲除实验表明此化合物的合成也与lxm2相关。通过色谱技术对新化合物进行分离纯化,结合核磁共振谱、高分辨质谱和二级质谱确定其结构为具有多重修饰的线性六肽,与雷可肽的N-端六氨基酸序列相同,命名为Lxm-N-六肽,该化合物没有检测到抗菌活性。     

波卓霉素生物合成基因簇的异源表达及产量提高

波卓霉素是从波卓链霉菌(Streptomyces bottropensis)中分离得到的,具有抗革兰氏阳性菌及支原体的生物活性,尤其重要的是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和抗万古霉素肠球菌有抑菌活性。试验通过构建基因组文库,PCR筛选获得包含完整波卓霉素合成基因簇的柯斯质粒4E11,通过接合转移的方法把4E11转化至天蓝色链霉菌M145中,对获得的异源表达株M145/4E11进行发酵,通过提取纯化和HPLC-MS检测,表明M145/4E11发酵液中产生了波卓霉素;试验并通过Red/ET重组系统,以红霉素启动子(ermE*P1)替换了波卓霉素生物合成簇抗性基因btmA和前提肽合成基因btmD的启动子,成功实现异源表达株M145/4E11波卓霉素的产量提高。     

链丝菌素生物合成基因簇的克隆及其异源表达

通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定,结合DNA序列测定,从刺孢吸水链霉菌AA97026中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇,获得1个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆1H5,其部分DNA序列与链丝菌素生物合成基因相似。含1H5的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份,表明1H5含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。     

基于II型毒素–抗毒素系统构建ε–聚赖氨酸合成酶的链霉菌稳定表达载体

鉴于ε–聚赖氨酸収酵过程对抗生素压力条件的依赖,尝试基于Ⅱ型毒素–抗毒素系统(relBE2sca)构建无选择压力下稳定表达ε–聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌表达系统:将抗毒素基因relB2sca与ε–聚赖氨酸合成酶基因pls克隆至表达载体,幵导入淀粉酶产色链霉菌pls缺失突变株,将毒素基因relE2sca整合至淀粉酶产色链霉菌的染色体(突变株YY3),获得包含ε–聚赖氨酸稳定表达的突变株YY1。经过多次传代,相比对照组,在不含抗生素压力条件下,突变株YY1依然能够稳定地合成ε–聚赖氨酸。毒素蛋白RelE2sca的表达会导致变铅青链霉菌、阿维链霉菌和链霉菌FR–008等常用链霉菌异源表达宿主的死亡,提示基于Ⅱ型毒素–抗毒素系统(relBE2sca)可作为一种通用的遗传标记。     

吸水逻霉菌应城亚种10—22限制性缺陷菌株的筛选和鉴定

吸水链霉菌应城亚种１０－２２对外源载体ＤＮＡ显示强烈的限限制性，来自变铅青链霉菌高拷贝质粒ＰＩＪ１０１的衍生载体ＰＩＪ７０２，能以较低频率转化吸水链霉菌应城亚种１０－２２的衍生菌株Ｑ１５１０。     

链霉菌GEMSM4(6)中聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的筛选及克隆

链霉菌GEMSM 4(6)的发酵产物具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性,同时还对酵母及丝状真菌尤其是植物病原菌,具有较强的抑制作用。本研究利用简并性引物对该链霉菌基因组中可能存在的聚酮合酶(PKS)和非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因进行PCR扩增及序列分析,找到了3个NRPS及15个PKS基因的片段,其中PKS基因与Streptomyces violaceusniger Tu 4113的PKS基因序列同源性最高,达到91%~99%;而NRPS基因与数据库中已知的NRPS基因序列同源性仅为60%~62%。为克隆NRPS生物合成基因簇,构建了链霉菌GEMSM 4(6)的基因组细菌人工染色体(BAC)文库,通过PCR筛选得到包含有这3个NRPS基因的克隆子,为后期的异源表达及基因组发掘分析提供基础。     

链霉菌Streptomyces sp. S9木聚糖酶基因xynBS9的克隆表达及性质分析

通过设计简并引物和构建基因组文库的方法从链霉菌Streptomyces sp.S9中克隆得到β-l,4-木聚糖酶基因xynBS9。该基因全长1 023 bp,编码340个氨基酸。将不带原基因信号肽编码序列的xynBS9以正确阅读框架克隆到表达载体pET-22b(+)上,并在大肠杆菌BL2l(DE3)中诱导表达。重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和疏水柱纯化后达到电泳纯。酶学性质分析表明,重组木聚糖酶最适温度为60℃,最适pH为6.5,在碱性条件下具有良好的稳定性。     

将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)转移到链霉菌染色体整合载体的构建

链霉菌抗生素的生物合成对培养环境中氧的供应相当敏感,为了改善这一溶氧问题,本研究通过将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)克隆到含ФC31int,attP基因的诱导型表达载体pU8600上,构建了可接合转移到链霉菌的整合型表达vgb基因的质粒pHZ1276。pHZ1276通过接合转移导入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans),所得重组子经Southern杂交验证后,进行诱导表达,菌体经破碎后所得蛋白粗提物经Western杂交和CO结合试验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。     

刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装

鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的2个脱氧糖结构单元,负责其合成的4种酶的基因(gtt、epi、gdh、kre)与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起,而是分散分布在染色体的3个位点上。为克隆到完整的多杀菌素生物合成基因簇,采用构建基因组文库、PCR扩增等手段从刺糖多孢菌NRRL18395染色体分别克隆gtt、epi、gdh和kre基因,并将其克隆组装在同一整合型载体上,以便于构建用于表达多杀菌素糖单元合成基因的表达载体。     

长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的免疫筛选与初步分析

蜱的免疫预防是目前国内外研究的热点,以抗血清为探针筛选cDNA表达文库是获取功能抗原基因的有效的方法之一,为了获得抗长角血蜱免疫原基因,用兔抗长角血蜱血清和兔抗长角血蜱唾液腺蛋白血清对长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库进行了免疫筛选,经过两轮筛选共获得34个阳性克隆,所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25.8使之亚克隆为重组质粒,用此质粒转化宿主菌JM109并进行序列测定和生物信息学分析.结果表明:在长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库中获得26个长角血蜱免疫相关cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱HL35、黏附素hlim3假定蛋白、热休克蛋白、NADH脱氢酶、钙网蛋白以及杂色花蜱和肩突硬蜱的二硫异构酶等具有同源性.所获阳性克隆为长角血蜱保护性抗原基因的筛选奠定了基础.     

地黄次生代谢产物生物合成基因表达水平与其含量的相关性分析

为了研究地黄次生代谢产物生物合成基因在不同地黄材料中的相对表达量,并分析其与次生代谢产物积累的关系,从地黄叶、地黄组培苗叶、地黄毛状根中提取总RNA,以地黄TIP41为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术分析梓醇、毛蕊花糖苷生物合成相关酶基因的表达量,并分别采用高效液相色谱法测定3种材料中梓醇和毛蕊花糖苷的含量、紫外分光光度法测定总环烯醚萜苷的含量,再对两者进行相关性分析。结果表明,3种不同地黄材料中次生代谢产物的生物合成相关酶基因的表达量及其含量差异较大。经相关性分析,地黄中梓醇的含量与GGPPS2基因的表达量呈显著正相关,总环烯醚萜苷的含量与GGPPS1、G10H基因的表达量也有显著相关性,说明GGPPS2与梓醇的合成有关,GGPPS1、G10H与总环烯醚萜苷的合成有关;而毛蕊花糖苷的含量与ADT、ASP5、4CL、C3H、HCT、GOT2基因的表达量均没有显著相关性。上述结果为地黄次生代谢产物生物合成途径的相关研究提供了参考。     

利用基因组发掘技术指导链霉菌SH-62中活性天然产物的分离及鉴定

通过生物信息学分析,利用基因组发掘技术发现链霉菌SH-62基因组中至少含有37个次级代谢产物的生物合成基因簇,除了有4个基因簇分别与已知的肠道菌素、潮霉素A、尼日利亚菌素和格尔德霉素的生物合成基因簇具有高度同源性以外,其他基因簇的功能鲜见报道。在不同发酵培养基上培养链霉菌SH-62,利用高分辨率的LC-MS对发酵产物进行分析,发现链霉菌SH-62确实能够产生肠道菌素、潮霉素A和尼日利亚菌素,从而证明了基因组发掘策略确实能够指导代谢产物的分离及鉴定。