转phyA基因玉米新种质的创制

【目的】构建植酸酶基因(phyA)根部特异表达的重组植物表达载体,并利用其创制磷高效利用的玉米新种质.【方法】通过PCR方法从携带phyA的表达载体pCAMBIA3301中扩增出phyA表达元件ZmGLU1P-phyA-Nos,并将其插入到带有耐盐基因的中间载体pCAMBIA1301-BADH上,获得phyA根特异表达的植物表达载体:pCAMBIA1301-ZmGLU1P-phyA-Nos,通过农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,并对再生植株进行分子生物学检测分析.【结果和结论】经PCR检测获得了9株T0代阳性植株;T1代植株的抗盐筛选、PCR检测、Southern杂交检测及RTPCR检测证明了phyA已经整合到玉米基因组中,获得6株T1代阳性植株;T2代植株的RT-PCR及根组织的酶活性测定结果表明,phyA在转基因植株根部大量表达,植酸酶活性平均比对照植株提高了10.9倍,活性最高的达到5.432 U/g.植酸酶基因在转基因植株根部大量特异表达,获得了转phyA的玉米新种质,为创制磷高效利用的玉米新种质、提高玉米的产量奠定了基础.     

大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3个品种中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明,双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar构建成功。将其转入到大豆中,分别获得吉农18、吉农28、吉农27T1代籽粒47,25和86粒,以及T2代转基因植株50株。RT-PCR结果表明,转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar的T2代转基因大豆。     

大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。     

抗虫Cry2Ab基因的原核表达及玉米的遗传转化

玉米的产量深受虫害的影响,抗虫Cry2Ab基因对玉米黏虫抗性有重要意义。利用外源抗虫基因Cry2Ab构建到原核表达载体pET-22b中,对其进行SDS-PAGE检测和抗黏虫性鉴定。SDS-PAGE检测结果表明,Cry2Ab基因编码的杀虫蛋白在大肠杆菌BL21中得到正确的表达,条带大小为70.68 kD;抗黏虫性鉴定结果表明,当Cry2Ab蛋白浓度为100μg/g时,对东方黏虫致死率达到86.66%。同时构建pCAMBIA3301-Cry2Ab-Bar植物表达载体,通过农杆菌介导法将外源抗虫基因Cry2Ab转入玉米自交系GSH9901愈伤组织中,利用除草剂筛选及PCR技术检测得到T₁转基因阳性植株4株。获得的转基因抗虫玉米植株为抗虫转基因玉米的研发及抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定

【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法,把重组到同一植物表达载体的cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS转入玉米骨干自交系9801和齐319（Q319）,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定,从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上,以非转基因自交系9801、Q319为对照,在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异,在抗虫性检测试验中,对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性,分别进行了田间和室内玉米螟接种试验,并以灌浆期玉米的籽粒和苞叶饲喂玉米螟幼虫检测其杀虫性。在草甘膦抗性鉴定试验中,对6叶期田间玉米植株喷洒大田除草用量的草甘膦溶液评估其应用价值;采用3倍应用剂量的草甘膦溶液喷施3叶期玉米植株测试其草甘膦耐受力。在抗旱性鉴定试验中,对10叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,观测转基因植株的表型变化并测定光合作用和叶绿素荧光等参数。【结果】选择出6个遗传稳定的兼抗亚洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的转基因玉米株系,其中株系L1-L3来自自交系9801,Q1-Q3来自自交系Q319。通过RT-PCR检测4个转基因的转录强度,证明它们在转基因植株中有效表达;利用Western blot方法检测cry1Ac蛋白的表达水平,确定其在玉米植株中稳定表达。植株抗虫性鉴定结果显示这6个株系在玉米营养生长期和灌浆期的抗虫能力均显著高于未转基因自交系。在草甘膦抗性测试中,转基因植株表现出明显高于未转基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期间,转基因植株能维持较强的光合能力和光系统Ⅱ活性,对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。【结论】将cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS一同转入玉米,赋予了植株抗玉米螟、抗除草剂草甘膦特性,提高了植株的抗旱性,达到生产中应用标准。培育出具有优良复合性状的转基因玉米新材料。     

大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其遗传转化

【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pSBA-Lox构建成功。将其转入到大豆中,对转化植株进行PCR、Southern杂交检测,结果显示,外源基因以单拷贝形式整合到植物基因组中,并能遗传给后代。T1代转基因植株的实时荧光定量PCR分析显示,转基因植株中SBA基因和Lox基因在籽粒中的表达量比未转化受体植株均明显降低,SBA基因表达量降低了35.9%~47.2%,Lox基因表达量降低了32.8%~56.1%,而在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大。【结论】获得了大豆凝集素和脂肪氧化酶表达量均明显降低的T1代转基因大豆。     

农杆菌介导甜高粱转Bt cry1Ah的研究

 【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”中。对获得的再生植株进行PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析。【结果】对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦（Bialaphos）梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%。RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T0甜高粱转基因植株中能够正常转录。Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69 ng•g-1叶片鲜重（FW）,最低的仅为1.93 ng•g-1叶片鲜重（FW）,平均为87.50 ng•g-1 FW。饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）表现为抗性。【结论】利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22的克隆与表达

【目的】克隆并表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiens,Bt)杀虫晶体蛋白cry1Ab22基因,为解决昆虫抗性问题提供有效途径,并为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料。【方法】根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计1对引物,并加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点。用全长基因PCR产物粘端定向克隆的方法,从苏云金芽孢杆菌S249菌株中扩增到1个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1Ab型基因cry1Ab22,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌TB1,进行诱导表达,并对表达产物的杀虫活性进行检测。【结果】cry1Ab22基因长度约为3.5 kb;其与已知的cry1Ab3型基因同源性最高,所编码的蛋白质存在5个氨基酸差异。cry1Ab22基因已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。SDS-PAGE电泳结果表明,cry1Ab22基因表达了170 ku左右的融合蛋白。cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50为225.1μg/mL。【结论】S249菌株含有新型的cry1Ab基因,且该基因表达的蛋白具有较强的杀虫活性。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

玉米转ABP9和ZmCBF3双基因植株的获得

[目的]获得转双基因的植株,研究植物逆境诱导基因ABP9和ZmCBF3的协同表达对玉米抗逆性的影响.[方法]通过农杆菌侵染的方法将ABP9和ZmCBF3基因同时转入玉米中,并对T0代植株进行分子鉴定.使用含有ABP9启动子驱动ABP9和ZmCBF3双基因载体的农杆菌侵染玉米幼穗,获得T0代种子;在田间通过对玉米苗喷洒草铵膦除草剂筛选获得具有草铵膦抗性的玉米植株.[结果]挑选10株抗性玉米苗小量提取DNA并进行PCR扩增分析,其中5个植株出现特异条带;大量提取PCR阳性玉米的DNA进行Southem杂交分析,9TQ-5号植株在与bar探针和ABP9探针杂交时均出现特异条带.[结论]9TQ-5号植株为转基因阳性植株,为后续试验提供了材料.     

抗稻瘟病基因Pib4的转基因研究

[目的]探讨抗稻瘟病基因Pib4的转基因。[方法]利用PCR法克隆Pib基因的NBS功能结构域到双元载体pCAMBIA1301上,以粳稻品种农大18的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,采用农杆菌介导法转化Pib4基因。[结果]经PCR和GUS活性检测表明外源基因已整合到水稻基因组中并获得表达;用稻瘟病菌接种阳性植株,获得了抗稻瘟病菌的水稻植株。[结论]为合理利用抗病基因和育种提供了参考。     

PGM-35Sbar玉米通用表达载体的构建及玉米转化研究

[目的]构建玉米通用表达载体,以期为利用转基因手段提高玉米对非生物胁迫的耐受性奠定基础。[方法]通过对现有的pGreen0229植物表达载体进行改造,构建含有CaMv35S启动子驱动的抗草胺膦筛选基因bar、可用于连接目的基因的玉米表达载体PGM-35Sbar,并通过花粉管通道法转化吉444玉米自交系。[结果]PGM-35Sbar玉米通用载体构建成功,转化玉米植株后,得到抗性植株14棵,经PCR检测其中有12棵为阳性植株。[结论]该研究为快速构建含有特定目的基因的玉米表达载体奠定了基础。     

拟南芥CBF3基因克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆拟南芥CBF3基因并构建植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3。[方法]从模式植物拟南芥中克隆分离出转录因子CBF3与逆境诱导型启动子Rd29A的DNA序列,构建植物表达载体。[结果]克隆得到的CBF3与GenBank数据库所公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为750bp;克隆克隆得到的Rd29A与GenBank数据库公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为1425bp。[结论]以双元载体pCAMBIA1301为基础,植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3被成功构建,对提高植物耐盐、耐旱和耐寒性有很大帮助。     

双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化

【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPT Ⅱ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种“优引三号”,对所获得的转基因植株进行PCR检验。【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5'∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5')的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化。[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5'∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

Enhanced Stem Nematode Resistance of Transgenic Sweetpotato Plants Expressing Oryzacystatin-I Gene

Enhanced stem nematode resistance of transgenic sweetpotato (cv. Lizixiang) was achieved using Oryzacyslatin-I (OCI)gene with Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. A. Tumefaciens strain EHA 105 harbors a binary vector pCAMBIA1301 with OCI gene, gusA gene and hptⅡ gene. Selection culture was conducted using 25 mg L-1 hygromycin. A total of 1715 plants were produced from the inoculated 1 450 cell aggregates of Lizixiang via somatic embryogenesis. GUS assay and PCR analysis of the putative transgenic plants randomly sampled showed that 90.54% of them were transgenic plants. Transgenic plants exhibited significantly enhanced resistance to stem nematodes compared to the untransformed control plants by the field evaluation with stem nematodes. Stable integration of the OCI gene into the genome of resistant transgenic plants was confirmed by Southern blot analysis, and the copy number of integrated OCI gene ranged from 1 to 4. Transgene overexpression in stem nematode-resistant plants was demonstrated by quantitative real-time PCR analysis. This study provides a way for improving stem nematode resistance in sweetpotato.     

Acquisition of Insect-Resistant Transgenic Maize Harboring a Truncated cry1Ah Gene via Agrobacterium-Mediated Transformation

A novel insecticidal gene cry1Ah was cloned from Bacillus thuringiensis isolate BT8 previously for plant genetic engineering improvement. Truncated active Cry1Ah toxin has a toxicity level similar to that of the full-length Cry1Ah toxin. In this study, plant expression vector pMhGM harboring truncated cry1Ah gene was transformed into maize (Zea mays L.) immature embryos by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation at which maize alcohol dehydrogenase matrix attachment regions (madMARs) were incorporated on both sides of the gene expression cassette to improve gene expression. A total of 23 PCR positive events were obtained with a transformation efficiency of 5% around. Bioassay results showed that events 1-4 and 1-5 exhibited enhanced resistance to the Asian corn borer (Ostrinia furnacalis). These two events were further confirmed by molecular analysis. Southern blot suggested that a single copy of the cry1Ah gene was successfully integrated into the maize genome. Western blot and ELISA showed that the foreign gene cry1Ah was expressed stably at high level in maize and could be inherited stably over generations. The results of a bioassay of T1-T4 transgenic maize plants indicated that the transgenic plants were highly toxic to the Asian corn borer and their resistance could be inherited stably from generation to generation. Thus, events 1-4 and 1-5 are good candidates for the breeding of insect-resistant maize.