番茄抗病信号激素的芯片表达谱分析

以番茄为试材,采用Aglient芯片和实时荧光定量PCR技术,研究了乙烯、茉莉酸甲酯和水杨酸3种激素处理后番茄中差异表达明显基因尤其是抗病相关基因,以期为进一步研究抗病信号激素响应和信号通路之间的协同作用提供参考依据。结果表明:分别用ET、MeJA和SA处理番茄幼苗后,筛选确定2 261、8 302和9 479个差异表达基因。GO分析表明,差异表达基因多与激素和防御反应、发育过程、信号转导、蛋白质代谢途径相关。其中经3种激素处理后,检测分别有178和598个共同上调和下调的差异表达基因;其中481个是已知或预测功能的基因。通过实时荧光定量PCR技术验证了10个差异表达基因的表达情况,结果与芯片数据趋势一致。     

茶树TCP转录因子的鉴定与表达分析

基于茶树基因组数据,通过生物信息学方法,对茶树全基因组TCP家族成员进行染色体定位、基因结构、编码蛋白特性和系统进化关系分析,同时采用荧光定量PCR验证茶树TCPs在不同组织部位的相对表达水平。结果表明,茶树全基因组中共鉴定出36个具有典型TCP保守结构域的转录因子基因,其CDS全长和编码氨基酸的数量分别在453～1 824 bp和150～607 aa之间,命名为CsTCP1～CsTCP30。系统进化分析显示,茶树TCP转录因子家族可分为2个亚族:ClassⅠ和ClassⅡ,并可进一步分为8个亚组(A～H),其中ClassⅠ亚族中的TCP蛋白属于PCF或TCP-P类型,而ClassⅡ可分为CYC/TB1和CIN两种类型。基因结构和保守结构域分析结果显示,同一亚组内,TCP蛋白具有相似的氨基酸结构和保守区域,而不同亚组之间具有较大差异,暗示不同类型TCP转录因子可能具有独特的生理功能。除CsTCP21b外,其余35个CsTCP基因在茶树叶片不同生长时期均有表达,但其表达水平呈现不同趋势;荧光定量分析显示其家族成员具有组织表达特异性;外源GA_3和ABA处理可以显著激活或抑制该家族基因成员的表达。     

菜薹BrWRKY57的特性及其对BrPPH1和BrNCED3的调控

从菜薹叶片中分离获得1个WRKY转录因子,命名为BrWRKY57。氨基酸序列比对及进化树分析发现BrWRKY57与拟南芥AtWRKY57同源性较高,含有1个WRKY保守结构域,且同属于WRKY转录因子家族Ⅱc亚族。实时荧光定量PCR分析表明,BrWRKY57随着菜薹叶片衰老表达水平升高,外源脱落酸(abscisic acid,ABA)处理显著诱导其表达。亚细胞定位和转录活性分析表明,BrWRKY57定位于细胞核,且在酵母和烟草体内都具有转录激活活性。双荧光素酶瞬时表达试验显示,BrWRKY57可以激活叶绿素降解相关基因BrPPH1和ABA合成相关基因BrNCED3的启动子活性。以上研究结果表明,BrWRKY57参与菜薹叶片衰老过程可能与影响叶绿素降解和ABA合成相关基因的表达有关。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。     

香蕉trihelix转录因子MaGTL1a的分离及特性

【目的】研究香蕉MaGTL1a转录因子的特性及其基因表达规律,探讨MaGTL1a转录因子在香蕉果实成熟过程中的作用。【方法】以香蕉果肉c DNA为模板,采用RT-PCR获得MaGTL1a序列;利用烟草瞬时表达法和酵母系统分析MaGTL1a亚细胞定位和转录调控活性;通过实时荧光定量PCR分析MaGTL1a在香蕉果实成熟过程中的表达;运用烟草BY2悬浮细胞瞬时表达法研究MaGTL1a启动子活性。【结果】MaGTL1a c DNA序列含有1个2 283 bp的开放阅读框,编码761个氨基酸,属于trihelix转录因子的GT-2亚家族;亚细胞定位和转录活性分析显示,MaGTL1a定位于细胞核,并在酵母和植物体内具有转录激活活性;实时荧光定量PCR和启动子活性试验表明,MaGTL1a转录水平和启动子活性均受乙烯诱导,并且MaGTL1a转录水平随着香蕉果实的成熟进程而明显增强。【结论】MaGTL1a是一个受乙烯诱导和核定位的转录激活子,可能参与了香蕉果实成熟的调控。     

黄瓜CMV复制酶基因相对表达定量PCR方法的建立

为了对黄瓜感染CMV植株体内CMV复制酶基因表达水平进行测定,建立CMV复制酶基因的相对表达定量检测技术,并用该方法开展黄瓜植株CMV抗性鉴定试验,以18SrRNA基因为对照,CMV复制酶基因为目标基因,设计引物,探索SYBRGreen实时荧光定量PCR反应体系,同时对CMV复制酶基因进行均一化处理,利用荧光阈值(Q值)计算p-防御素基因的相对表达量。结果表明:利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术测定黄瓜CMV复制酶基因相对表达定量具有较高的准确性,耗时短,该技术可应用于CMV抗性植株的筛选。     

黄瓜microRNA171的克隆与功能分析

为了解microRNA171(miR171)对黄瓜的调控作用,从华北型黄瓜‘北京截头’中克隆了Csa-miR171家族的4个miRNA前体序列Csa-miR171a、Csa-miR171b、Csa-miR171c、Csa-miR171d,对前体序列进行比对与进化分析,预测成熟序列的靶基因并进一步开展了拟南芥遗传转化功能研究。结果表明,4个前体共剪切出两种成熟序列Csa-miR171a和Csa-miR171b,系统进化显示,Csa-miR171a、Csa-miR171b、Csa-miR171c、Csa-miR171d分别与甜瓜Cme-miR171e、Cme-miR171c、Cme-miR171a、Cme-miR171b同源性最近,与拟南芥、水稻、番茄等较远;Csa-miR171a、Csa-miR171b成熟序列主要靶向GRAS转录因子蛋白家族基因,拟南芥中过表达Csa-miR171a前体改变了叶片形态、颜色、抽薹时间、根、果实、花器官形态等多个表型性状。     

芹菜NAC转录因子基因AgNAC1的克隆及其对非生物胁迫的响应

通过RT-PCR方法,从芹菜‘六合黄心芹’和‘文图拉’中分别克隆获得编码NAC转录因子的基因AgNAC1。利用生物信息学方法分析其编码氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等,采用荧光定量PCR技术检测基因在不同非生物胁迫下的表达水平。结果表明：‘六合黄心芹’和‘文图拉’AgNAC1开放阅读框长度均为957 bp,编码318个氨基酸,其蛋白质相对分子量分别为36.89和36.77 kD,理论等电点分别为5.94和5.78。AgNAC1蛋白与不同植物中NAC家族成员同源性比对和进化树分析表明,其与胡萝卜DcNAC属于同一个分支,进化距离最近。蛋白功能域预测显示,AgNAC1有多个α螺旋和β转角二级结构单元。荧光定量PCR结果表明,AgNAC1在芹菜叶中表达量最高,具有组织特异性,同时对高温、低温、干旱和盐胁迫均有响应。‘六合黄心芹’中AgNAC1的表达水平在高温处理24 h达到最高。‘文图拉’中AgNAC1的表达水平在高温、低温及盐处理后2 h和8 h高于对照,呈现先下降后上升的趋势,在干旱处理4 h时表达水平最高。     

‘砀山酥梨’实时荧光定量PCR内参基因的筛选

对'砀山酥梨'不同组织器官及不同非生物胁迫条件下叶片中可以稳定表达的内参基因进行筛选,为后续荧光定量PCR试验提供参考基因。分别对生长45 d的'砀山酥梨'嫁接苗进行低温、高温和盐胁迫处理,采集不同处理时间的叶片;还分别采集'砀山酥梨'4个果实发育时期的果肉(分别为花后32、65、99、143d)、叶片、成熟果皮、花粉、花柱共26个样品。利用实时荧光定量PCR技术对4个传统内参基因:β微管蛋白基因(TUB)、多聚泛素酶基因(UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)和转录延伸因子基因(EF1α),以及通过转录组数据筛选出来的3个新内参基因Cytochrome b561(CyB)、WD-repeat protein(WDP)和mRNA capping enzyme(mRCE),共计7个内参基因在26个样品中的表达差异情况进行测定。结果表明:通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper 3个软件对其表达稳定性进行分析,最终筛选出在不同组织及非生物胁迫条件下稳定表达的最优内参基因。UBQ在高温和盐胁迫处理的'砀山酥梨'叶片中表达最稳定,可作为优选内参基因;在低温胁迫处理下,TUB和WDP在'砀山酥梨'叶片中表达较稳定,可作优选内参基因;WDP在'砀山酥梨'不同组织器官中表达最稳定。不同内参基因在同一物种不同组织及胁迫处理条件下表达稳定性具有较大差异,在进行荧光定量PCR试验时,应根据具体的试验材料和方法选择最优内参基因。     

桃生长素反应因子和生长素/吲哚乙酸蛋白家族基因的克隆及表达分析

生长素对果实发育起着重要的调控作用。生长素反应因子（auxin response factor,ARF）和生长素/吲哚乙酸蛋白（auxin/indoleacetic acids protein,Aux/IAA）是生长素信号转导系统中的两个关键因子,在转录水平上对生长素参与的生理活动进行调控。为探索生长素调控桃果实发育的机制,选取ARF家族的1 个基因PpARF1,Aux/IAA 家族的5 个基因PpIAA3、PpIAA9、PpIAA17、PpIAA26 和PpIAA29,克隆其全长cDNA 序列并进行生物信息学分析,对它们在桃果实不同发育时期中果皮和种子的表达进行qRT-PCR 检测。序列分析表明：这6 个基因的编码区全长分别为2 037、594、1 194、618、384 和723 bp,分别编码678、197、397、205、127 和240 个氨基酸;氨基酸序列比对分析显示桃PpARF1 蛋白序列和草莓的FvARF1（XP_004300014.1）同源性最高,达到90.56%,PpIAA 家族的5 个蛋白同源性很低,只有23.77%;荧光定量PCR 结果显示,在花后52 d（果实发育硬核期）,PpIAA3 和PpIAA17 在中果皮中的表达量显著升高;PpIAA26、PpIAA29 和PpARF1 在种子中的表达量显著升高。预示生长素可能在桃果实发育硬核期发挥着重要的调控作用。     

黄瓜耐低氮基因型的筛选及遗传分析

以14个黄瓜基因型为筛选材料,将盛果期所检测的10个指标与耐低氮指数进行相关性分析和通径分析,发现叶绿素b含量是最理想的黄瓜耐低氮性筛选指标。以此指标筛选得到D0328和D0422两个叶绿素b含量最高和最低的品种,分别作为父本和母本形成杂交组合。通过D0422×D0328构建6个世代（P1、P2、F1、F2、BC1P1和BC1P2）遗传分析体系,分析结果表明：黄瓜耐低氮性是数量性状,符合加性-显性模型,以加性效应为主;广义遗传力和狭义遗传力均较高,其遗传受环境因素的影响小。     

黄瓜叶面喷施硅肥对果实糖分和维生素C积累及相关酶的影响

研究了黄瓜叶面喷施硅肥对其生长、产量、果实糖分、维生素C及相关酶活性和基因表达量的影响。结果表明：叶面喷施硅肥显著促进了黄瓜生长,增加了单株产量,提高了果实中碱性转化酶（NI）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）及半乳糖内脂脱氢酶（GaILDH）活性,提高了果实果糖、葡萄糖和维生素C含量。其中,1.420 g · L^-1单硅酸处理效应最显著,其果糖、葡萄糖和维生素C含量分别较对照高13.79%、18.08%和75.11%。实时荧光定量PCR分析表明,叶面喷施单硅酸的黄瓜果实碱性转化酶–3（NI-3）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和半乳糖内脂脱氢酶（GaILDH）基因表达量显著提高。     

γ-氨基丁酸浸种对不同温度胁迫下黄瓜种子萌发和幼苗生长的影响

以清白黄瓜为材料,研究外源γ-氨基丁酸(GABA)浸种对不同温度胁迫下黄瓜种子萌发、幼苗生长及光合特性的影响。研究结果表明,次低温(20℃/10℃)、次高温(35℃/28℃)、高温(40℃/35℃)显著抑制了黄瓜种子的萌发和胚根的生长,同时使黄瓜幼苗的株高、壮苗指数、根冠比以及根系活力显著降低,净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)呈现下降趋势。外源GABA浸种能够显著提高温度胁迫下黄瓜种子的萌发和胚根生长速率,并能促进黄瓜幼苗的生长,提高黄瓜叶片的光合特性,其中以10 mmol/L GABA浸种处理效果最好。     

长期培养的黄瓜毛状根中外源基因遗传稳定性分析

 对在固体培养基上培养3 年的黄瓜转gfp 基因毛状根进行gfp 和rol 位点系列基因的PCR 扩增、gfp 的荧光定量PCR、Western blot 杂交以及荧光观察分析。结果显示,由组成型启动子35S 驱动的gfp 在转录水平上能正常表达,而且能够翻译出编码蛋白;此外,培养3 年后的毛状根,能扩增出与毛状根形态构成有关的rol 系列基因。本研究结果表明长期培养的毛状根能保持其遗传稳定性,这为利用毛状根长期工厂化生产外源基因表达的蛋白产物和药用植物的活性成分提供了理论依据。     

辣椒全基因组中LBD转录因子的鉴定与表达分析

利用生物信息学的方法,从辣椒基因组中鉴定出45个LBD基因,这些基因分布于辣椒9条染色体上。该家族成员内含子数整体上不超过3个,结构相对简单。进化关系显示辣椒LBD基因可分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类,细分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅰe、Ⅱa和Ⅱb等7个亚类。不同组织和发育时期的表达模式研究发现,该基因家族具有一定的时空表达特异性。qRT-PCR结果表明,热激胁迫可以明显激活或抑制部分LBD基因的表达,其中ClassⅡ类基因较ClassⅠ类对高温具有更高的敏感性。     

朱顶红实时荧光定量PCR中不同组织器官内参基因的筛选

以朱顶红（Hippeastrum vittatum）不同组织器官为试验材料,通过实时荧光定量PCR技术检测肌动蛋白基因（ACT）、亲环蛋白基因（CYP）、转录延伸因子基因（EF-1α）、甘油醛–3–磷酸脱氢酶基因（GAPDH、GAPDH2）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）这7个常用的看家基因的表达水平,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1α和GAPDH2的表达水平较高,而且相对稳定;其次为TUB、TUA和GAPDH。geNorm和NormFinder软件分析结果显示,在不同组织器官中CYP和GAPDH2的表达稳定性最高,其次是EF-1α;进一步分析表明,CYP的表达稳定性虽然较高,但是其表达丰度较低,故不适合作为内参基因。BestKeeper分析表明,EF-1α和GAPDH2在不同组织器官中的表达稳定性较好。综合分析表明,EF-1α和GAPDH2在所有样品中表达量较高,稳定性较好。以筛选出来的EF-1α、GAPDH2以及EF-1α + GAPDH2作为内参基因检测朱顶红花器官调控基因PI的表达水平,结果表明,以上述两个基因及其组合为内参基因得到的PI表达模式相同,而且在花器官中的表达高于茎盘和根,基本符合PI调控花模型的机理。因此,EF-1α、GAPDH2或EF-1α + GAPDH2可作为朱顶红的内参基因进行相关基因的表达调控研究。     

黄瓜根结RDR酶基因的分离与表达分析

 基于黄瓜（Cucumis sativus L.）自交系9930全基因组序列,采用RT-PCR的方法,分离出根结形成过程中表达的RDR基因,共获得了5个CsRDR基因：CsRDR1a、CsRDR1b、CsRDR1c、CsRDR2和CsRDR6（HQ738485 ~ HQ738489）。qPCR定量分析表明,5个基因在接种根结线虫后的不同时期表达量都有不同程度的增加。CsRDR1a、CsRDR1b、CsRDR2和CsRDR6在接种线虫早期（6 h）相对表达量明显增加;而CsRDR1c在接种36 h时相对表达量达到最高,从而表明CsRDR基因与黄瓜根结的发育相关。     

杧果乙烯受体基因MiETR1b的分离与表达分析

以‘紫花杧’杧果（Mangifera indica L.‘Zihua’）子叶切段为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到乙烯受体基因ETR1的cDNA及基因组DNA全长,命名为MiETR1b。该基因cDNA全长2 530 bp,开放读码框为2 220 bp,编码739个氨基酸;其基因组DNA全长4 116 bp,其中从起始密码子到终止密码子为3 305 bp,含有6个外显子和5个内含子。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示MiETR1b与MiETR1亲缘关系最近,与CsERS1、DlETR1、TcERS1、PtrETR1有较高的同源性,且具有保守的GAF域和组氨酸激酶域。这些结果表明,MiETR1b为ETR1家族同源基因。荧光定量PCR结果表明,MiETR1b在杧果子叶切段不定根形成过程中在远轴端和近轴端都有表达,其中远轴端0.25 ~ 2 d的表达量显著上调;吲哚丁酸（IBA）和2,3,5–三碘苯甲酸（TIBA）预处理后分别在1 d和6 h显著下调。另一方面,在培养的初期,即0.5 ~ 1 d,乙烯释放量相对较高,4 d及其以后的乙烯释放量急剧下降,表明杧果子叶切段不定根形成过程中有较多乙烯生成,提示MiETR1b可能参与了不定根的形成。     

黄瓜细胞分裂素合成关键酶IPT 基因家族序列特征及其表达分析

 为了分析黄瓜IPT家族基因,以及黄瓜IPT基因CsIPT与果实发育的关系,以黄瓜单性结实自交系‘EC1’和非单性结实自交系‘8419s-1’为试材,应用荧光定量PCR技术,在分析不同器官中CsIPT表达特征的基础上,寻找果实发育中的作用基因,进一步分析这些基因在果实发育过程中的表达特征。结果表明：8个黄瓜IPT基因（CsIPT1 ~ CsIPT8）核苷酸相似性在17.3% ~ 33.2%范围内,氨基酸长度在280 ~ 504 AA之间,具有共同的ATP/GTP结合功能域[(A,G)-X₄-G-K-(S,T)],CsIPT4氨基酸序列中包含有一个锌指基序（C-X₂-C-X_12,18-H-X₅-H）类似序列;黄瓜幼果中CsIPT3、CsIPT5、CsIPT7和CsIPT8表达水平较高;CsIPT1、CsIPT3、CsIPT4和CsIPT5的表达量在未发育的果实中有增加的趋势,CsIPT2和CsIPT8在未发育的果实中表达基本无变化,而在授粉后发育的果实中表达量很高,说明这两个基因可能与授粉后黄瓜果实发育调控有关。此外,CsIPT2在天然单性结实材料‘EC1’果实发育早期表达较高,推测其在黄瓜单性结实果实发育中发挥着重要作用。