工程菌DH5a感受态细胞的制备及质粒pGEM的转化研究

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是源于海洋生物多管水母(aequoia victoria)的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光，能在活细胞内稳定表达，本试验首先从含有GFP的大肠杆菌中提取质粒，并利用胶回收试剂盒纯化质粒，采用氯化钙法将工程菌DH_5a制成感受态细胞，然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞中，使得工程菌DH_5a转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌，并表达绿色荧光蛋白，接种于加氨苄青霉素的LB培养基上，筛选阳性克隆。     

利用绿色荧光蛋白标记产肠毒素大肠杆菌F4ac

利用电击转化法将表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的原核表达载体pTurboGFP-B转化到产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）F4ac中，获得表达绿色荧光的菌株ETEC F4ac-GFP。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）结果显示，转化菌株表达绿色荧光蛋白编码基因，且可以在蓝光仪和荧光显微镜下清晰地观察到转化菌株发出绿色荧光；将ETEC F4ac-GFP与IPEC-J2细胞系进行体外粘附试验，在细胞水平验证了转化菌株荧光表达的稳定性与可靠性，且ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的胞粘附能力。CCK-8(Cell Counting Kit-8)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明，ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的毒力。本研究为深入探究ETEC F4ac致病机理提供了工具菌株。     

胞外区基因的克隆、可溶性表达和纯化

 从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)₁₅-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。     

5类等位基因鸡BF2胞外区基因的克隆、可溶性表达和纯化

从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)₁₅-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。     

FOXL2基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

为了构建叉头框L2(Forkhead box L2,FOXL2)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因复制缺陷型腺病毒载体,试验将克隆的FOXL2基因与IRES-GFP片段通过酶切、纯化等方法共同连接到pShuttle-CMV载体中,再与pAdEasy-1腺病毒质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,得到复制缺陷型AD-FOXL2腺病毒载体,再用PacⅠ酶线性化后转染HEK293细胞,观察绿色荧光表达,并测量病毒效价。结果表明:将AD-FOXL2腺病毒载体用PacⅠ酶线性化后,得到1个大于23 kb的大片段和1个4.5 kb的特异性小片段,证明同源重组成功;将所得的腺病毒载体转染HEK293细胞,可以观察到GFP的表达,证明包装成功,并测得病毒效价为1×10-8.61/0.1 mLTCID50。     

大肠杆菌不耐热肠毒素LTB大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体的构建及表达

为了获取大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,试验以产肠毒素大肠杆菌的大质粒为模板,采用PCR技术扩增大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,并将PCR产物克隆至p MD18-T载体中构建克隆质粒p MD18T-LTB;通过酶切、纯化将LTB基因与大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体p W425et连接构建成重组质粒p W425et-LTB,将p W425et-LTB转化至thy A基因缺陷型大肠杆菌X13感受态细胞中,再进行SDS-PAGE、Western-blot检测。结果表明:重组大肠杆菌表达出LTB蛋白,且表达的融合蛋白能被LTB特异性抗体识别。     

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及纯化

【目的】实现A型塞内卡病毒（Seneca virus A,SVA）VP1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立SVA抗体液相芯片技术检测方法。【方法】根据GenBank收录的SVA VP1基因序列（登录号：KY747514.1）,基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成VP1基因,克隆到pCold TF载体,构建重组质粒pCold TF-VP1。将重组质粒pCold TF-VP1转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,进行IPTG诱导表达。通过优化诱导时间及IPTG浓度得出最佳诱导表达条件。采用His标签镍柱纯化VP1重组蛋白,将纯化后的SVA VP1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用Luminex 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度（MFI）,从而判断阴阳性,以用于猪血清中SVA抗体的检测。【结果】重组质粒pCold TF-VP1成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达。经诱导表达在约82 ku处出现阳性条带。当重组菌株诱导条件为16 ℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L、诱导时间为3 h时,VP1蛋白表达量最高;经Western blotting分析,可在82 ku处出现明显条带。将VP1 蛋白与荧光微球偶联,阴性对照（背景）的平均荧光值为17（＜100）。测试孔的平均MFI为2 339.5（＞2 000）,证明SVA VP1蛋白与微球偶联成功,偶联成功的荧光微球可用于检测猪血清中SVA抗体的检测。【结论】本研究在大肠杆菌中成功表达并纯化了SVA VP1蛋白,初步建立了SVA抗体液相芯片检测方法,为后续研究奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒S1蛋白在Vero细胞的表达与分布

将传染性支气管炎病毒（IBV）ZJ971 S1基因亚克隆到绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP—C2中，成功构建重组表达质粒pEGFP—ZJ971-S1。重组质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞，借助荧光显微镜在转染后4h观察到S1—GFP融合蛋白的瞬时表达。免疫细胞化学染色（ICC）结果显示，抗ZJ971 S1D蛋白单克隆抗体和鸡抗IBVZJ971全病毒血清特异性识别了S1基因转染细胞，表明S1蛋白在Vero细胞中得到有效表达。荧光显微镜观察和ICC均表明，S1表达蛋白主要分布在转染细胞的胞浆内，而胞核中未见分布，提示IBVS1蛋白内可能存在与病毒装配相关的细胞定位信号。     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

不同组成型启动子对乳酸菌表达系统外源基因表达影响的比较

【目的】构建不同组成型启动子的乳酸菌表达载体系统,评价不同启动子驱动外源基因表达的活性,筛选出强表达的启动子,为后续研究乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。【方法】以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pPG为骨架,将表达载体中启动子序列分别替换为组成型强启动子Pldh、PHH和Phce,利用PCR方法扩增报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),并在下游多克隆位点中分别插入荧光素酶(LUC)、EGFP和Ampr报告基因,构建9种乳酸菌表达质粒,电转入副干酪乳杆菌HLJ-27感受态细胞,筛选获得9株重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR检测报告基因在重组菌中的mRNA转录水平,利用Western blotting和间接ELISA检测蛋白的表达量,并检测表达蛋白的活性,以评估3个启动子的活性强弱。【结果】PCR成功扩增出大小约720 bp的EGFP基因和850 bp的Ampr基因。Western blotting结果显示,在9株重组乳酸菌中,分别成功表达出了58 ku的LUC蛋白、26 ku的EGFP蛋白和28 ku的Ampr蛋白。实时荧光定量PCR和间...     

鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A克隆表达及纯化

为了制备鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)外膜蛋白A(Outer membrane protein-A,OmpA)。本研究将RA云南流行株外膜蛋白OmpA基因PCR克隆至质粒pET32a,构建重组表达质粒pET32a-OmpA,将其转化大肠杆菌TransB感受态细胞,用IPTG诱导表达,并将表达产物进行初步纯化。结果表明OmpA基因在大肠杆菌原核表达系统中获得了高效表达,表达的OmpA重组蛋白分子量为61 kDa,表达量占菌体蛋白的40%。OmpA重组蛋白经纯化后纯度达90%。本研究为RA的ELISA抗原的制备奠定了基础。     

卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI的构建及表达

为构建卵泡抑制素与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因疫苗pEGISI，将pcISI中的乙肝表面抗原（HBsAg）S基因及插入S基因中的抑制素（INH）基因片段酶切回收；PCR扩增pcISI中INH基因片段，调整阅读框，一起融合到pEGFP-N1中EGFP基因的5’端，构建ISI-EGFP融合表达质粒pEGISI。酶切和测序鉴定表明，重组质粒pEGISI构建成功。将pEGISI转染293T细胞，16h后检测到绿色荧光，48h检测到强烈荧光，说明融合基因在293T细胞获得高表达；ELISA检测证实，表达产物ISI—EGFP融合蛋白具有INH的抗原抗体反应原性。质粒pEGISI的成功构建及表达为抑制素基因免疫的机理及安全性研究奠定了基础。     

利用重叠延伸PCR构建红色荧光蛋白布鲁氏菌表达载体

为了构建能够在布鲁氏杆菌宿主细胞和宿主个体中稳定表达红色荧光蛋白的载体,试验通过PCR分别获得核糖体结合位点-红色荧光蛋白（RBS-Red）与布鲁氏菌特异DNA（BDNA）片段,利用重叠延伸PCR获得RBS-Red-BDNA重叠片段;将重叠片段插入pLB载体,利用Sma Ⅰ与Sac Ⅱ对重组pLB载体和pMC-221质粒进行双酶切后连接目的片段,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;提取的质粒电转布鲁氏菌16M菌株感受态细胞,将电转后的16M-pMC-Red菌株涂布于含有氯霉素抗性的布鲁氏菌培养基,倒置荧光显微镜下观察菌株颜色;16M-pMC-Red菌株侵染小鼠巨噬细胞,制成细胞爬片,激光共聚焦荧光显微镜下观察小鼠巨噬细胞,鉴定红色荧光蛋白表达情况。结果显示,利用重叠延伸PCR技术成功改造了红色荧光蛋白布鲁氏菌双启动子表达载体;将改造获得的质粒电转进布鲁氏杆菌16M菌株,菌株荧光鉴定能够稳定表达红色荧光蛋白;电转成功的16M-pMC-Red菌株侵染小鼠巨噬细胞后,可以稳定表达红色荧光蛋白。试验构建的发红光质粒pMC-Red可以与发绿光质粒pMC-221联用,为不同种株布鲁氏菌之间的联合研究奠定了基础,也为布鲁氏菌病检测提供了一个以荧光检测为指标的新策略。     

猪圆环病毒2型多抗原表位串联在大肠杆菌中表达与反应原性分析

为将猪圆环病毒2型(PCV2)的多个抗原表位串联,并在大肠杆菌中表达,本研究人工合成PCV2多抗原表位串联的编码序列并与pET32a(+)载体连接构建重组表达质粒。将其转化到BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达。检测结果显示,多抗原表位串联基因在大肠杆菌中获得表达并以包涵体形式存在;表达的融合蛋白分子量约为27 ku。将包涵体溶解并经Ni-His柱纯化得到纯化的目的蛋白,western blot和ELISA结果显示,该表达产物具有较好的反应原性。     

绿色荧光蛋白的真核表达及其单克隆抗体制备

[目的] 构建表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组猪痘病毒（recombinant Swinepox virus,rSWPV）,制备抗GFP单克隆抗体。[方法] 首先合成3'-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV（SWPV-JX20G株）同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。[结果] PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体效价高达1：256 000。采用杂交瘤技术制备了9株能稳定分泌抗EGFP-His单克隆抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA和Western blotting结果显示,9株单克隆抗体中的7株针对GFP的线性表位,另外2株单克隆抗体针对GFP的构象表位。[结论] 本研究成功制备了EGFP-His蛋白和9株抗EGFP-His的单克隆抗体,为后续建立GFP的免疫学检测方法提供了必备材料。     

利用重叠延伸PCR构建红色荧光蛋白布鲁氏菌表达载体

为了构建能够在布鲁氏杆菌宿主细胞和宿主个体中稳定表达红色荧光蛋白的载体,试验通过PCR分别获得核糖体结合位点-红色荧光蛋白(RBS-Red)与布鲁氏菌特异DNA(BDNA)片段,利用重叠延伸PCR获得RBS-Red-BDNA重叠片段;将重叠片段插入pLB载体,利用SmaⅠ与SacⅡ对重组pLB载体和pMC-221质粒进行双酶切后连接目的片段,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;提取的质粒电转布鲁氏菌16M菌株感受态细胞,将电转后的16M-pMC-Red菌株涂布于含有氯霉素抗性的布鲁氏菌培养基,倒置荧光显微镜下观察菌株颜色;16M-pMC-Red菌株侵染小鼠巨噬细胞,制成细胞爬片,激光共聚焦荧光显微镜下观察小鼠巨噬细胞,鉴定红色荧光蛋白表达情况。结果显示,利用重叠延伸PCR技术成功改造了红色荧光蛋白布鲁氏菌双启动子表达载体;将改造获得的质粒电转进布鲁氏杆菌16M菌株,菌株荧光鉴定能够稳定表达红色荧光蛋白;电转成功的16M-pMCRed菌株侵染小鼠巨噬细胞后,可以稳定表达红色荧光蛋白。试验构建的发红光质粒pMC-Red可以与发绿光质粒pMC-221联用,为不同种株布鲁氏菌之间的联合研究奠定了基础,也为布鲁氏菌病检测提供了一个以荧光检测为指标的新策略。     

猪圆环病毒2型Rep蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达和纯化

为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白，试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因，将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上，构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞，获得P0代重组杆状病毒，经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒，将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养，收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白，通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明：经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带；通过荧光显微镜观察，在转染后第1天就出现绿色荧光，第4～5天出现大量绿色荧光，P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4～5天出现大量绿色荧光；P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现...     

携带绿色荧光蛋白基因重组猫泛白细胞减少症病毒的拯救

本研究旨在构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPV),以便更快速有效的检测中和抗体。参照GenBank中GFP基因序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得携带AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的GFP基因,并对pFPV质粒进行定点突变,从而获得AgeⅠ和NheⅠ酶切位点,然后用AgeⅠ和NheⅠ同时双酶切pFPV和GFP基因,经4℃过夜连接、转化,成功构建携带GFP基因的重组猫泛白细胞减少症病毒质粒pFPV-GFP,应用脂质体转染法将重组质粒pFPV-GFP导入猫肾细胞(F81),利用GFP独特的发光机制可在荧光显微镜下对标记的重组病毒rFPV-GFP进行细胞内活体观察,利用Western blotting鉴定重组病毒rFPV-GFP中GFP的表达情况。结果显示,重组质粒pFPV-GFP转染F81细胞24 h时可观察到绿色荧光蛋白,且随着转染时间的延长观察到的绿色荧光蛋白数量增多,说明重组质粒pFPV-GFP成功转染到F81细胞中,Western blotting鉴定出GFP在重组病毒rFPV-GFP中稳定表达。本研究通过在pFPV上成功插入GFP并拯救出病毒,说明pFPV上可以插入外源基因,为其他外源基因在pFPV上的插入奠定基础,同时GFP的插入为FPV的研究提供了更加有利的研究工具,为FPV的基础研究以及中和抗体的快速检测奠定基础。     

绿色荧光蛋白在鸡胚成纤维细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pEGFP-C1转染到培养至第二代的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,同时使用活体DNA染料Hoechst3334(2H342)对CEF细胞核荧光染色,通过荧光倒置显微镜和RT-PCR方法检测GFP的表达产物。在荧光倒置显微镜下可见CEF的胞质和核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质,在H342作用下,细胞核呈现蓝色荧光;转染细胞中转录产物经RT-PCR扩增后,在凝胶上可见与GFP基因片段分子量大小一致的条带。可见,GFP基因可以被转染至CEF中,并在CEF中表达。     

卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI的构建及表达

为构建卵泡抑制素与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因疫苗pEGISI,将pcISI中的乙肝表面抗原(HBsAg)S基因及插入S基因中的抑制素(INH)基因片段酶切回收;PCR扩增pcISI中INH基因片段,调整阅读框,一起融合到pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,构建ISI-EGFP融合表达质粒pEGISI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pEGISI构建成功。将pEGISI转染293T细胞,16h后检测到绿色荧光,48h检测到强烈荧光,说明融合基因在293T细胞获得高表达;ELISA检测证实,表达产物ISI-EGFP融合蛋白具有INH的抗原抗体反应原性。质粒pEGISI的成功构建及表达为抑制素基因免疫的机理及安全性研究奠定了基础。