气肿疽梭菌CctA基因真核表达载体的构建与鉴定

为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-CctA,对测序正确的基因进行序列分析后亚克隆至pVAX-1真核表达载体,并对构建的pVAX1-CctA真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果表明:成功扩增了CctA基因目的片段,并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA。说明试验成功构建了气肿疽CctA基因真核表达载体。     

气肿疽梭菌CctA基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D_{450 nm}值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。     

气肿疽梭菌NanA基因克隆及生物信息学分析

为了对气肿疽梭菌NanA基因进行克隆及生物信息学分析,试验根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列设计并合成1对特异性引物,以气肿疽梭菌总DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD18-T载体中,对测序正确的NanA基因进行序列对比分析,对NanA蛋白进行理化性质分析与二级结构预测,同时使用在线软件预测NanA蛋白三级结构。结果表明:成功扩增出气肿疽梭菌Nan A基因,与参考序列相比,共存在3处核苷酸突变,核苷酸序列和氨基酸序列与NCBI公布的JF4135 NanA基因序列的同源性均为99.8%。NanA蛋白分子质量约为71 ku,具有较高的抗原指数,二级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,有多个抗原表位区域。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA12的生物信息学分析

为分析并预测弓形虫致密颗粒蛋白GRA12基因编码蛋白的结构、功能以及其作为疫苗候选抗原的可能性,本研究从Gen Bank数据库获取GRA12基因序列,通过在线蛋白分析专家系统(Expasy)并结合GENERUNR、DNAStar、DNAMAN等生物信息学分析软件对GRA12序列的编码区进行分析、对该基因编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构域、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等信息预测。结果表明:该基因全长1 311 bp,编码436个氨基酸,蛋白性质稳定,理论分子质量约为47.8 ku,无信号肽,有6个跨膜区,14个丝氨酸磷酸化位点、7个苏氨酸磷酸化位点、3个酪氨酸磷酸化位点、18个O-糖基化位点、3个乙酰化蛋白附着位点、1个酪氨酸硫酸化位点、1个潜在的N-糖基化位点、1个棕榈酰化位点,15个潜在的抗原表位。研究结果分析说明GRA12有潜力成为弓形虫疫苗候选抗原。     

弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析

为了分析并预测弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1(Tg MAPK1)基因编码蛋白的结构与功能,探讨其作为疫苗候选抗原及潜在药物靶点的可能性,试验从Gen Bank数据库获取Tg MAPK1基因序列,采用在线蛋白分析专家系统(http://ca.expasy.org/),结合DNAMAN、DNAStar等生物信息学软件对该序列的编码区进行分析,预测该基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等。结果表明:该基因全长为1 772 bp,编码区为133~1 731 bp,编码532个氨基酸。编码蛋白性质稳定,理论分子质量为58.376 ku。Tg MAPK1蛋白有5个跨膜区,有3个N端糖基化位点、7个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个环腺苷酸蛋白激酶磷酸化位点、10个N端肉豆蔻酰化位点及1个酰胺化位点;无信号肽,二级结构以无规卷曲为主;Tg MAPK1基因主要存在于弓形虫虫体外膜上,有20个潜在的抗原表位。说明弓形虫Tg MAPK1基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原。     

一株肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC的克隆及生物信息学分析

本研究旨在对肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）鞭毛蛋白FliC基因进行克隆，并对所获序列进行生物信息学分析。提取该菌基因组DNA作为模板，参考GenBank中肠炎沙门氏菌FliC基因序列设计1对引物，利用PCR克隆获得FliC基因，将其插入到克隆载体中进行测序，应用生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列，利用BLAST进行同源性比对，并构建系统进化树，同时对该基因编码蛋白的理化性质、亲水性、信号肽、跨膜结构域、糖基化位点和B细胞抗原表位、二级结构、三级结构等进行分析。结果显示，试验成功克隆了1 518 bp的目的基因，编码505个氨基酸。同源性比对发现，FliC基因相对保守，与大肠杆菌属有较高的同源性。该蛋白的化学分子式为C₂₂₅₄H₃₇₀₁N₆₅₇O₈₀₃S₄，理论分子质量为52.981 ku，理论等电点为4.91；不稳定指数为16.86，是稳定存在的亲水蛋白质。结构分析结果显示，该蛋白没有信号肽或跨膜结构域，但具有8个N-糖基化位点、13个O-糖基化位点和60个磷酸化位点，同时还含有26个B细胞线性结合位点和5个T细胞结合位点。二级结构分析显示，α-螺旋、β-转角、延伸链和无规卷曲分别占43.76%、3.76%、20.99%和31.49%。本试验成功克隆了肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC，并对其序列结构进行了分析，为进一步研究鞭毛在肠炎沙门致病过程中的作用及基因工程疫苗的研制提供理论依据。     

一株肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC的克隆及生物信息学分析

本研究旨在对肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)鞭毛蛋白FliC基因进行克隆,并对所获序列进行生物信息学分析。提取该菌基因组DNA作为模板,参考GenBank中肠炎沙门氏菌FliC基因序列设计1对引物,利用PCR克隆获得FliC基因,将其插入到克隆载体中进行测序,应用生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,利用BLAST进行同源性比对,并构建系统进化树,同时对该基因编码蛋白的理化性质、亲水性、信号肽、跨膜结构域、糖基化位点和B细胞抗原表位、二级结构、三级结构等进行分析。结果显示,试验成功克隆了1 518bp的目的基因,编码505个氨基酸。同源性比对发现,FliC基因相对保守,与大肠杆菌属有较高的同源性。该蛋白的化学分子式为C2254H3701N657O803S4,理论分子质量为52.981ku,理论等电点为4.91;不稳定指数为16.86,是稳定存在的亲水蛋白质。结构分析结果显示,该蛋白没有信号肽或跨膜结构域,但具有8个N-糖基化位点、13个O-糖基化位点和60个磷酸化位点,同时还含有26个B细胞线性结合位点和5个T细胞结合位点。二级结构分析显示,α-螺旋、β-转角、延伸链和无规卷曲分别占43.76%、3.76%、20.99%和31.49%。本试验成功克隆了肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC,并对其序列结构进行了分析,为进一步研究鞭毛在肠炎沙门致病过程中的作用及基因工程疫苗的研制提供理论依据。     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒(FPV)北京株(FPV-BJ 05株)NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%～99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%～98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒（FPV）北京株（FPV-BJ 05株）NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007 bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%~99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%~98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

牦牛低氧诱导因子-1α基因克隆及蛋白质结构分析

试验采用RT-PCR方法,以麦洼牦牛脾脏cDNA为模板扩增牦牛低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因,并运用生物信息学软件对其序列进行分析。结果发现,扩增得到的麦洼牦牛HIF-1α基因编码区长为2 472 bp,编码823个氨基酸;蛋白质预测结果显示,该蛋白质分子质量为92.13 ku,等电点5.09,为亲水性蛋白,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,有69个磷酸化位点和4个N-糖基化位点;系统进化树显示,麦洼牦牛与牦牛、野牦牛、普通牛亲缘关系最近。本试验成功克隆麦洼牦牛HIF-1α基因并对其序列进行了分析,为进一步研究HIF-1α基因的功能提供参考。     

草原红牛ACSL3基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在克隆草原红牛长链酰基辅酶A合成酶3(long-chain acyl-CoA synthetase 3,ACSL3)基因编码区并对其进行生物信息学分析,同时在mRNA和蛋白质水平上分析ACSL3基因在草原红牛不同组织中的表达差异。利用RT-PCR技术和TA克隆的方法获得草原红牛ACSL3基因CDS序列;利用在线软件对ACSL3基因进行生物信息学分析,分析ACSL3基因与其他物种的同源性并构建系统进化树,分析ACSL3基因编码蛋白质的基本理化性质、潜在磷酸化位点、O-糖基化位点、N-糖基化位点、信号肽、二硫键、跨膜区结构、亚细胞定位及该基因编码蛋白的二级结构、三级结构;通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测ACSL3基因在草原红牛各组织间的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,试验成功克隆了草原红牛ACSL3基因CDS区,全长2 163 bp,编码720个氨基酸,蛋白分子质量为80.28 ku,理论等电点为8.74,属于亲水性蛋白。通过NCBI中BLAST比对发现,草原红牛与牛、绵羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡的ACSL3基因核苷酸序列同源性分别为99%、97%、93%、91%、88%、88%和78%;系统进化树结果表明,草原红牛与牛、绵羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。该蛋白序列有7个二硫键,66个磷酸化位点,9个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,不存在信号肽,但存在1个跨膜区。二级结构和三级结构分析结果表明,ACSL3蛋白通过无规则卷曲连接,蛋白质结构以α-螺旋和β-转角为主,为混合型蛋白。mRNA和蛋白表达量检测结果显示,ACSL3基因在肾脏和肌肉组织中表达量较高,显著高于其他组织(P<0.05);在胃、肝脏和心脏中中度表达,显著高于脾脏、肺脏、肠和脂肪(P<0.05);在脾脏、肺脏、肠和脂肪中相对低表达,说明草原红牛ACSL3基因可能与体内脂肪沉积和脂质代谢等调控功能有关。本试验结果为进一步研究ACSL3基因在草原红牛中脂质代谢及脂肪沉积等方面的调控作用提供了基础材料。     

草原红牛ACSL3基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在克隆草原红牛长链酰基辅酶A合成酶3(long-chain acyl-CoA synthetase 3,ACSL3)基因编码区并对其进行生物信息学分析,同时在mRNA和蛋白质水平上分析ACSL3基因在草原红牛不同组织中的表达差异。利用RT-PCR技术和TA克隆的方法获得草原红牛ACSL3基因CDS序列;利用在线软件对ACSL3基因进行生物信息学分析,分析ACSL3基因与其他物种的同源性并构建系统进化树,分析ACSL3基因编码蛋白质的基本理化性质、潜在磷酸化位点、O-糖基化位点、N-糖基化位点、信号肽、二硫键、跨膜区结构、亚细胞定位及该基因编码蛋白的二级结构、三级结构;通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测ACSL3基因在草原红牛各组织间的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,试验成功克隆了草原红牛ACSL3基因CDS区,全长2 163 bp,编码720个氨基酸,蛋白分子质量为80.28 ku,理论等电点为8.74,属于亲水性蛋白。通过NCBI中BLAST比对发现,草原红牛与牛、绵羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡的ACSL3基因核苷酸序列同源性分别为99%、97%、93%、91%、88%、88%和78%;系统进化树结果表明,草原红牛与牛、绵羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。该蛋白序列有7个二硫键,66个磷酸化位点,9个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,不存在信号肽,但存在1个跨膜区。二级结构和三级结构分析结果表明,ACSL3蛋白通过无规则卷曲连接,蛋白质结构以α-螺旋和β-转角为主,为混合型蛋白。mRNA和蛋白表达量检测结果显示,ACSL3基因在肾脏和肌肉组织中表达量较高,显著高于其他组织(P0.05);在胃、肝脏和心脏中中度表达,显著高于脾脏、肺脏、肠和脂肪(P0.05);在脾脏、肺脏、肠和脂肪中相对低表达,说明草原红牛ACSL3基因可能与体内脂肪沉积和脂质代谢等调控功能有关。本试验结果为进一步研究ACSL3基因在草原红牛中脂质代谢及脂肪沉积等方面的调控作用提供了基础材料。     

猪PFKL基因克隆及生物信息学分析

试验旨在探究猪精液6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase,PFKL)基因的理化性质和结构特点,以期阐明糖酵解在精子发生过程中的生理作用及调控机制。通过RT-PCR技术扩增PFKL基因,将获得的基因片段插入到pUC57载体上进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其氨基酸序列、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、抗原位点、功能注释等。结果表明,PFKL基因全长2 349 bp,编码782个氨基酸,蛋白质分子质量为83.819 ku,等电点为6.96,为酸性蛋白质,分子式为C_(3674)H_(5897)N_(1051)O_(1109)S_(40)。猪源PFKL基因与鼠、鸭、羊、牛、猩猩、人的参考序列同源性均高达80.0%以上。该蛋白不存在跨膜结构和信号肽区域,含有2个N-糖基化修饰位点、14个O-糖基化位点、35个磷酸化位点。PFKL蛋白三维建模结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,与肌肉型磷酸果糖激酶和血小板型磷酸果糖激酶的同源性分别为68.24%和70.84%。PFKL基因含有的27个抗原位点强弱不同,柔韧性分布较均匀,有较高的表面可塑性,且存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,为具有较多潜在B细胞抗原表位的亲水性蛋白。GO功能注释分析结果表明,PFKL基因具有碳水化合物激酶活性、磷酸果糖激酶活性,能够参与己糖代谢和单糖代谢。本研究结果为改善精子品质和提高精卵结合发生率奠定了分子生物学基础。     

猪PFKL基因克隆及生物信息学分析

试验旨在探究猪精液6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase,PFKL）基因的理化性质和结构特点,以期阐明糖酵解在精子发生过程中的生理作用及调控机制。通过RT-PCR技术扩增PFKL基因,将获得的基因片段插入到pUC57载体上进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其氨基酸序列、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、抗原位点、功能注释等。结果表明,PFKL基因全长2 349 bp,编码782个氨基酸,蛋白质分子质量为83.819 ku,等电点为6.96,为酸性蛋白质,分子式为C₃₆₇₄H₅₈₉₇N₁₀₅₁O₁₁₀₉S₄₀。猪源PFKL基因与鼠、鸭、羊、牛、猩猩、人的参考序列同源性均高达80.0%以上。该蛋白不存在跨膜结构和信号肽区域,含有2个N-糖基化修饰位点、14个O-糖基化位点、35个磷酸化位点。PFKL蛋白三维建模结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,与肌肉型磷酸果糖激酶和血小板型磷酸果糖激酶的同源性分别为68.24%和70.84%。PFKL基因含有的27个抗原位点强弱不同,柔韧性分布较均匀,有较高的表面可塑性,且存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,为具有较多潜在B细胞抗原表位的亲水性蛋白。GO功能注释分析结果表明,PFKL基因具有碳水化合物激酶活性、磷酸果糖激酶活性,能够参与己糖代谢和单糖代谢。本研究结果为改善精子品质和提高精卵结合发生率奠定了分子生物学基础。     

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列（登录号：AF130119.1）设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（61.78%）,无规则卷曲次之（20.78%）。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。     

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列(登录号:AF130119.1)设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高(61.78%),无规则卷曲次之(20.78%)。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。     

禽波氏杆菌外膜蛋白A的克隆测序与生物信息分析

本文旨在克隆禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA的编码基因,并预测OmpA蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA在免疫保护中所起的作用。作者对禽波氏杆菌的外膜蛋白ompA基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对禽波氏杆菌OmpA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。禽波氏杆菌ompA基因全长597bp,编码199个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和β-片层,少见β-转角;推测OmpA蛋白有5个B细胞优势抗原表位区域、2个糖基化位点。本研究为进一步分析禽波氏杆菌免疫机理、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定理论基础。     

气肿疽梭菌延边样的分离鉴定

牛、羊等反刍动物的气肿疽病是由气肿疽梭菌感染引起的严重危害畜牧业发展的一种疾病,本研究从延边州延吉市采集疑似气肿疽梭菌感染的牛肝脏、脾脏、肌肉等组织进行气肿疽梭菌的分离鉴定。结果表明:经病原学检查、生化鉴定、动物试验及分子生物学鉴定,本试验成功对气肿疽梭菌进行了分离,该菌株细胞毒素、cct A基因与Gen Bank上已发表的气肿疽梭菌ATCC 10092菌株的同源性达到99.0%,此结果为该地区气肿疽病的免疫和微生态防治提供了重要的参考依据。     

藏羊白细胞介素-7基因的PCR扩增及生物信息学分析

为了获得藏羊白细胞介素-7（interleukin-7,IL-7）基因序列,并研究其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本试验采用RT-PCR方法,从藏羊脾脏中扩增了IL-7基因,应用DNAStar软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,与经BLAST比对后的参考序列进行同源性比对,并构建系统进化树,同时利用DNAStar软件和在线服务器预测该基因编码蛋白的二级结构、三级结构、亲水性、信号肽和蛋白翻译后修饰位点。结果表明,藏羊IL-7基因长度为531 bp（含终止密码子）,编码176个氨基酸。藏羊IL-7基因与绵羊、山羊、藏羚羊、水牛、瘤牛、美洲草原野牛、黄牛和牦牛的IL-7基因核苷酸序列同源性在97.2%~99.8%之间,氨基酸序列同源性在94.9%~99.4%之间,藏羊与绵羊的亲缘关系最近。蛋白结构预测结果表明,IL-7蛋白主要由α螺旋组成,是一种亲水性和分泌型蛋白。该蛋白含有6种蛋白质翻译后修饰位点,包括1个N-豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点、1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、3个N-糖基化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。本研究结果可为藏羊IL-7基因的进一步研究与临床应用提供参考。     

撒坝猪SPDEF基因克隆及其生物信息学分析

为明确猪SPDEF基因的遗传特性,试验对不同猪种SPDEF基因的CDS区进行序列扩增、测序、拼接,并对撒坝猪SPDEF基因CDS序列进行生物信息学分析。采用PCR直接测序法测定猪SPDEF基因外显子序列,运用SeqMan进行序列拼接。采用生物信息学软件分析撒坝猪SPDEF基因开放阅读框及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、功能结构域,并构建系统进化树。结果表明,各猪种SPDEF基因编码区仅在外显子1、2分别检测到1个同义突变(C13971T、C16541T),表明该基因编码区在所检测的猪群中高度保守。生物信息学分析发现,该基因有1个长1 092 bp的完整开放阅读框;SPDEF蛋白中丝氨酸(Ser)含量最高(10.7%),体外理论半衰期为30 h,属于不稳定的亲水性蛋白;该蛋白不存在信号肽及跨膜结构,存在39个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,亚细胞定位于细胞质;二级结构预测中,参与无规则卷曲的氨基酸最多(55.10%),其次是α-螺旋(28.37%);功能结构域预测发现,该蛋白存在1个ETS功能结构域和1个SAM-PNT功能结构域。系统进化树结果显示,撒坝猪与牛、绵羊和山羊的亲缘关系较近。本研究为进一步分析撒坝猪SPDEF基因的功能奠定了一定的理论基础。