LKB1基因对卵巢颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。     

干扰KISS1基因对猪卵巢颗粒细胞功能的影响

【背景】卵泡是卵巢的基本结构和功能单位,其主要功能是排卵和分泌激素。颗粒细胞能促进卵泡发育,其过度凋亡能抑制卵泡发育,诱导卵泡闭锁,进而降低雌性动物发情频率,影响雌性动物繁殖力。现已有研究发现,KISS1在卵巢组织中发挥着重要作用。【目的】研究通过干扰KISS1,以阐释KISS1对猪卵巢颗粒细胞凋亡、周期及分泌雌激素能力的影响,为完善KISS1在猪颗粒细胞中的分子调控机制提供一定的依据。【方法】设计KISS1的干扰片段KISS1-siRNA,转染体外培养的母猪卵巢颗粒细胞,通过实时定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）检测干扰KISS1对母猪卵巢颗粒细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信号通路部分基因转录水平的影响;采用流式检测法、Annexin V- FITC及ELISA技术,分别探究干扰KISS1对颗粒细胞周期、凋亡及雌二醇（estradiol, E₂）分泌量的影响,最后使用qRT-PCR技术检测KISS1对雌激素受体及雌激素信号通路关键基因转录水平的影响。【结果】在猪颗粒细胞内,干扰KISS1后,PI3K通路激活相关基因PIK3CG、PI3CI、PDK1及AKT1转录水平下降,其中关键基因AKT1的转录水平显著降低（P<0.05）,PI3K通路激活抑制相关基因FOXO3、TSC2及BAD转录水平也有所降低;干扰KISS1后,颗粒细胞周期在细胞分裂间期（G0/ G1）阻断,细胞的凋亡率显著上升,细胞中E₂的浓度显著降低（P<0.01）,雌激素受体ESR1和ESR2及雌激素通路的基因Star、CYP17、3B-HSD、17B-HSD和CYP19A转录水平也相应显著下降（P<0.05）。【结论】KISS1能够参与猪颗粒细胞PI3K和雌激素通路,干扰KISS1能够使卵巢颗粒细胞阻滞在细胞分裂间期,促进颗粒细胞凋亡,降低颗粒细胞分泌雌激素的能力,表明KISS1对于卵巢颗粒细胞的分裂与生长、雌激素分泌具有重要作用。     

外泌体microRNA在猪成熟和闭锁卵泡中的表达差异及功能分析

【目的】通过分析成熟卵泡液外泌体（mature follicular fiuid Exosomes, mffEXs）和闭锁卵泡液外泌体（atretic follicular fiuid Exosomes, affEXs）miRNA的表达差异,探索卵泡液外泌体（EXs）miRNA在卵泡发育和闭锁过程中的调控作用。【方法】本研究通过抽提4—6 mm猪成熟发育和闭锁卵泡的卵泡液分离外泌体,进行粒径分析及Western Blot检测对EXs进行鉴定,接下来对特征性EXs携带的miRNA测序和功能富集分析,筛选关键信号通路和差异基因。最后,将mffEXs和affEXs作为添加剂进行颗粒细胞培养,利用Q-PCR检测技术分析关键基因的表达,验证两类卵泡液内EXs miRNA在卵泡发育中的调控功能。【结果】成功分离了mffEXs和affEXs,对比mffEXs测序结果,affEXs中有90个miRNA上调表达,220个miRNA下调表达,表明了卵泡液中的miRNA表达水平与调控卵泡发育有关;KEGG富集分析结果显示两类卵泡的差异信号通路主要集中在Ras、cAMP、P53和MAPK等信号通路,涉及调控卵母细胞发育、减数分裂以及颗粒细胞细胞周期等生物学功能。在闭锁卵泡中,上调表达的ssc-let-7a和ssc-miR-133a-3p分别潜在靶向调控细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）和胰岛素生长因子（IGF1）,抑制了G1和G2/M期的运转和类固醇激素代谢,促使颗粒细胞周期运转受阻和颗粒细胞凋亡,引起卵泡闭锁的发生;下调的ssc-miR-21-5p潜在靶向肿瘤抑癌基因（P53）,抑制细胞周期运转,促使颗粒细胞凋亡。在体外培养的颗粒细胞中分别添加mffEXs和affEXs,Q-PCR结果显示CDK1在mffEXs中显著上调表达,而P53显著下调表达,表明了测序分析结果的可靠性。这些结果均显示了affEXs中miRNA表达水平的变化促使颗粒细胞凋亡和细胞周期阻滞,引起卵泡闭锁。【结论】猪affEXs携带miRNA增加了对CDK1、IGF1和P53的表达调控,抑制颗粒细胞细胞周期运转和类固醇激素代谢等信号通路,引起颗粒细胞凋亡,导致卵泡闭锁。     

miR-221-3p靶向BCL2L11调控小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡

【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡,同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗,文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响,为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上,获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p,利用半定量和组织荧光定量（RT-qPCR）分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况;通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况;构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体,在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照,采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系;在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达,使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响;同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织;RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和 BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达,miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期,而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期,表现出负调控的现象;双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性（P<0.05）,阴性对照组则没有显著影响;过表达miR-221-3p,靶基因BCL2L11 mRNA表达水平显著降低,同时,卵泡颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas的表达量也显著降低（P<0.05）;EdU试验分析显示,过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%,极显著高于阴性对照组的10.43%（P<0.01）。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件,BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一,miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡,该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。     

二花脸猪linc-NORFA核心启动子鉴定与转录调控分析

【目的】 前期研究证实linc-NORFA作为母猪繁殖性状候选基因参与调控卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞凋亡过程,进一步鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子并分析其转录调控机制,为解析linc-NORFA介导猪卵泡闭锁的分子机制奠定理论基础并提供新的研究思路。【方法】 采集二花脸猪耳组织样品并提取基因组DNA,利用PCR扩增和测序技术获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列;通过构建缺失表达荧光报告载体并利用荧光素酶活性试验鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子;利用生物信息学分析二花脸猪linc-NORFA核心启动子区序列特征与潜在的转录因子结合位点;构建猪FOXO1真核生物表达载体并进一步采用Western blot、qRT-PCR以及荧光素酶活性试验分析转录因子FOXO1过表达对二花脸猪linc-NORFA转录的影响;利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术鉴定转录因子FOXO1与二花脸猪linc-NORFA核心启动子区的结合能力。【结果】 通过克隆测序与序列拼接共获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列1 734 bp,其中包含两个潜在的CpG岛;利用荧光素酶活性试验证实linc-NORFA核心启动子位于-988 — -684 bp（转录起始位点作为+1）,生物信息学分析表明二花脸猪linc-NORFA核心启动子上包含多个转录因子的结合元件,例如ESR2、FOXO1、E2F1、BRCA1以及NFIC等;另外,ChIP试验还证实在猪卵巢颗粒细胞中FOXO1作为转录因子直接靶向结合在linc-NORFA的核心启动子区;进一步通过试验证实FOXO1过表达可显著下调linc-NORFA核心启动子区活性（P<0.01）,同时显著抑制体外培养的猪卵巢颗粒细胞中linc-NORFA的表达（P<0.01）。【结论】 鉴定了二花脸猪linc-NORFA核心启动子区,同时证实FOXO1作为转录因子能够与linc-NORFA核心启动子区特异性结合,进而抑制后者的转录活性与表达。研究结果对探究linc-NORFA在猪卵泡闭锁过程中显著下调的分子机制具有重要意义。     

对母猪生殖调控的研究

【目的】研究促性腺激素抑制激素（GnIH）mRNA在母猪组织器官中的分布,不同剂量GnIH对母猪卵巢类固醇激素合成和细胞增殖相关蛋白表达的影响,及GPR147与GnRH的形态学关系。从分子、细胞水平和形态学角度,探讨GnIH在下丘脑-垂体-性腺轴对母猪生殖调控的作用机制,丰富神经内分泌学的内容。【方法】以30日龄健康仔母猪为研究对象,采用半定量RT-PCR方法研究GnIH mRNA在母猪24个组织中的分布定位。采集青年母猪卵巢样品,分离卵巢颗粒细胞,研究不同剂量GnIH（10^-6、10^-8、10^-10 和 10^-12 mol·L^-1）对体外培养的母猪卵巢颗粒细胞类固醇激素（雌二醇,孕酮）的合成、细胞增殖相关蛋白（cyclin B1,PCNA）表达的影响。取30日龄健康仔母猪下丘脑,制作脑片,采用荧光双标记,激光共聚焦显微镜观察拍照分析GPR147与GnRH的形态学关系。【结果】GnIH mRNA主要在母猪的中枢神经系统中表达,尤其是在间脑表达含量最高。在外周组织,如子宫、卵巢、垂体中也有一定量表达。不同剂量的GnIH作用于体外培养的卵巢颗粒细胞,其中10^-6和10^-10 mol·L^-1 GnIH能极显著地抑制雌二醇的分泌（P＜0.01）, 但不同剂量的GnIH对孕酮分泌的影响并不显著。GnIH能极显著地抑制卵巢增殖相关蛋白PCNA和cyclin B1的表达（P＜0.01）。此外,激光共聚焦结果显示GPR147与GnRH在下丘脑室旁核及视前区存在密切联系。【结论】GnIH可在下丘脑水平通过其受体直接作用于GnRH神经元,影响GnRH的合成和分泌,进而在中枢水平调控母猪的生殖活动。在外周生殖器官中,GnIH可通过影响卵巢激素的分泌和细胞增殖相关蛋白的表达参与母猪的生殖调控。     

山羊卵泡发育相关基因的筛选及分析

【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F_2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。     

GnIH对母猪生殖调控的研究

【目的】研究促性腺激素抑制激素(GnIH)mRNA在母猪组织器官中的分布,不同剂量GnIH对母猪卵巢类固醇激素合成和细胞增殖相关蛋白表达的影响,及GPR147与GnRH的形态学关系。从分子、细胞水平和形态学角度,探讨GnIH在下丘脑-垂体-性腺轴对母猪生殖调控的作用机制,丰富神经内分泌学的内容。【方法】以30日龄健康仔母猪为研究对象,采用半定量RT-PCR方法研究GnIH mRNA在母猪24个组织中的分布定位。采集青年母猪卵巢样品,分离卵巢颗粒细胞,研究不同剂量GnIH(10-6、10-8、10-10和10-12 mol·L-1)对体外培养的母猪卵巢颗粒细胞类固醇激素(雌二醇,孕酮)的合成、细胞增殖相关蛋白(cyclin B1,PCNA)表达的影响。取30日龄健康仔母猪下丘脑,制作脑片,采用荧光双标记,激光共聚焦显微镜观察拍照分析GPR147与GnRH的形态学关系。【结果】GnIH mRNA主要在母猪的中枢神经系统中表达,尤其是在间脑表达含量最高。在外周组织,如子宫、卵巢、垂体中也有一定量表达。不同剂量的GnIH作用于体外培养的卵巢颗粒细胞,其中10-6和10-10 mol·L-1 GnIH能极显著地抑制雌二醇的分泌(P0.01),但不同剂量的GnIH对孕酮分泌的影响并不显著。GnIH能极显著地抑制卵巢增殖相关蛋白PCNA和cyclin B1的表达(P0.01)。此外,激光共聚焦结果显示GPR147与GnRH在下丘脑室旁核及视前区存在密切联系。【结论】GnIH可在下丘脑水平通过其受体直接作用于GnRH神经元,影响GnRH的合成和分泌,进而在中枢水平调控母猪的生殖活动。在外周生殖器官中,GnIH可通过影响卵巢激素的分泌和细胞增殖相关蛋白的表达参与母猪的生殖调控。     

固醇类物质对鹅颗粒细胞胆固醇转运相关基因表达的影响

【目的】揭示胆固醇转运相关基因在鹅不同发育阶段卵泡中的表达模式及固醇类物质对颗粒细胞上述基因表达的影响。【方法】首先应用RT-qPCR技术检测SREBP-2、STADR4、STAR和CYP11A1在产蛋高峰期鹅卵巢内不同发育阶段卵泡中的mRNA表达水平;然后分离鹅F1卵泡颗粒细胞体外培养,24 h后分别添加不同浓度胆固醇、25-羟胆固醇和洛伐他汀(胆固醇合成限速酶抑制剂)处理,最后使用MTT法检测细胞活性和RT-qPCR技术检测上述基因表达量。【结果】四个基因在不同发育阶段卵泡中的表达模式相似;高浓度胆固醇显著增加细胞活性(P0.05),25-羟胆固醇和洛伐他汀则降低细胞活性。随着胆固醇浓度升高,四个基因表达量均先升高后下降;25-羟胆固醇显著抑制SREBP-2和STAR的表达(P0.05);升高洛伐他汀浓度使SREBP-2表达量先降低后升高,与其余三个基因相反。【结论】胆固醇转运和类固醇激素合成相关基因表达量受固醇种类和浓度调节,并且与卵泡类固醇激素合成密切相关,这为揭示鹅卵泡发育机制和提高产蛋量提供了理论参考。     

大豆异黄酮对牦牛卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

[背景]大豆异黄酮主要包括染料木素和大豆苷元,发挥类雌激素样作用,能够清除自由基,促进细胞增殖.颗粒细胞是卵泡内重要的细胞群体,其生理状态与卵巢功能直接相关.颗粒细胞凋亡常引起卵泡闭锁.牦牛是青藏高原特有物种之一,但其繁殖率低,其具体机制尚不明确.卵巢颗粒细胞是研究雌性动物生殖调控机制的理想细胞模型.[目的]探讨大豆异...     

猪卵泡闭锁过程中circINHBB的鉴定及其对颗粒细胞凋亡的影响

【背景】卵泡的发育状况和成熟排卵数量是哺乳动物的繁殖力和生产性能的重要决定因素。卵泡闭锁是卵泡停止发育并发生退化的过程,可能发生在卵泡发育的各个阶段,而闭锁的发生与卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡情况密切相关,而颗粒细胞的凋亡过程十分复杂并且受到各种细胞因子的调控作用。环状RNA（circRNA）是近年来在生物体内发现的一种环状结构非编码RNAs（ncRNAs）。研究证明circRNA普遍存在于各个组织且参与到各种生理过程的调节中,但其在家畜繁殖学领域,尤其是猪卵巢和卵泡中的表达变化、位置分布和生物学功能研究较少。抑制素（INH）是一种性腺糖蛋白激素,主要由雌性动物卵巢卵泡的颗粒细胞产生,是控制哺乳动物排卵的重要因子。前期实验发现,猪卵泡中INHβ亚基INHBB编码基因的mRNA的前体可能形成一个circRNA,即circINHBB。【目的】在猪中等有腔卵泡组织中验证circINHBB的序列结构及其在颗粒细胞中的分布情况;分析其在健康、闭锁卵泡中的表达差异;在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中探索了circINHBB对细胞凋亡的调控作用,并对circINHBB可能介导的功能性miRNA做出预测,为家畜繁殖领域的circRNAs研究扩宽思路,为提高家畜繁殖力研究提供参考。【方法】采集中等大小猪卵泡,进行RNA提取及反转录获得猪卵泡的cDNA,利用反向引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经Sanger测序证明circINHBB的序列和环状结构;设计circINHBB的特异性荧光探针,运用FISH实验验证circINHBB在猪卵泡颗粒细胞核、质中的分布情况;然后,通过外观、激素和颗粒细胞密度指标选取健康和闭锁两组,用qRT-PCR检测circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的表达差异;最后,设计circINHBB的特异性siRNA（si-circINHBB）,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,转染si-circINHBB及其对照,利用流式细胞术检测circINHBB对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用,预测circRNA可能参与的miRNA调节。【结果】PCR及Sanger测序验证了circINHBB在猪卵泡中的特异性存在,且证实了circINHBB是由INHBB编码基因的mRNA的前体经反向可变剪切形成的环状结构RNA;FISH实验进一步验证了circINHBB在猪卵泡颗粒细胞的细胞质中分布;qRT-PCR结果证实,与猪健康卵泡相比,circINHBB的表达量在猪闭锁卵泡中显著降低;流式细胞术检测结果表明当敲减circINHBB后,猪卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著上升,说明circINHBB对猪卵泡颗粒细胞的凋亡有显著的抑制作用;生物信息学分析表明,circINHBB可能与10个已知miRNA相互作用,通过TGF-β、Notch等信号通路参与调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁过程。【结论】在猪卵泡中验证了circINHBB的环状结构及胞质中的特异性表达分布,证实了其在闭锁卵泡中表达量低于健康卵泡,通过体外实验证实了circINHBB是细胞凋亡的抑制因子,可能通过吸附相关miRNA参与调节卵泡的发育和闭锁过程。     

陆地棉细胞色素P450超家族基因GhCYP85A2-1的克隆与功能分析

【目的】研究细胞色素P450超家族CYP85A亚家族基因在棉花株高发育中的生物学功能,为陆地棉株高分子育种提供理论依据和基因资源。【方法】 采用同源克隆方法,从陆地棉中克隆CYP85A家族基因GhCYP85A2-1,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing, VIGS)构建GhCYP85A2-1基因沉默载体,利用qRT-PCR技术检测侵染棉花幼苗的基因表达量。【结果】 GhCYP85A2-1基因沉默植株的株高显著降低,基因的表达量也显著下降。【结论】 GhCYP85A2-1基因在棉花株高发育过程中起到重要调控作用。     

新疆马铃薯甲虫对噻虫嗪的抗性监测及其细胞色素P450基因表达分析

【目的】以世界性害虫马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）为研究对象,筛选其参与噻虫嗪解毒的细胞色素P450主效基因。【方法】于2018、2019年利用点滴法监测新疆察布查尔县、伊宁县、塔城市、乌鲁木齐市和吉木萨尔县11个马铃薯甲虫田间种群对噻虫嗪的抗性水平,并测定分析噻虫嗪LD₅₀处理72 h后成虫中3种主要解毒酶细胞色素P450酶（P450）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和酯酶（EST）的活性变化。利用Illumina HiSeq^TM 2500 高通量测序技术进行转录组测序,获得抗性和敏感种群之间的差异表达基因（DEG）,运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术验证3个P450基因并分析6个P450基因（CYP4C1、CYP9e2、CYP305a1、CYP9Z25、CYP9Ya和CYP9Yc）在不同种群及噻虫嗪处理后的表达情况。【结果】抗性监测发现,2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS种群成虫对噻虫嗪抗性倍数（RR）分别达到5.99、8.81、10.86和20.33倍和11.82、14.05倍,为低至中水平抗性。解毒酶活性测定结果表明,2个敏感种群URMQ2、URMQ3以及2个抗性种群YN2、JMS成虫分别经噻虫嗪LD₅₀处理72 h后其P450活性均显著增加,分别为对照的1.76、2.75、1.91和1.66倍。另外,URMQ3种群的GST（CDNB和DCNB为底物）及URMQ2、YN2种群的EST活性显著升高,分别为对照的1.19、2.10倍和1.35、1.91倍。转录组分析表明,通过合并组装分别获得噻虫嗪敏感和抗性种群样品56 872 051和62 249 136个原始序列数据以及55 903 706和61 082 076个过滤后的序列数据,过滤后的序列长度分别为8.39和9.16 G,碱基错误率均为0.03%。抗性种群中差异表达的P450基因13个,其中2个基因显著上调。3个上调的P450基因CYP4C1、CYP9e2和CYP305a1的qRT-PCR检测结果与转录组测序结果基本一致,qRT-PCR分析还发现CYP9Ya、CYP9Yc、CYP4C1、CYP305a1和CYP9Z25在抗性种群成虫中表达量显著增加,噻虫嗪LD₅₀处理均可引起URMQ2种群4龄幼虫和成虫CYP9Ya、CYP9Yc表达量显著上调。相关性分析发现成虫对噻虫嗪的抗性水平与CYP9Ya表达量呈显著正相关。【结论】CYP9Ya可能在马铃薯甲虫中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,其他基因的作用也不能排除。     

P450基因在氯虫苯甲酰胺不同抗性品系小菜蛾中的表达及功能分析

【目的】以十字花科蔬菜害虫小菜蛾（Plutella xylostella）为研究对象,筛选参与小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的主要细胞色素P450解毒基因,为阐明不同抗性水平小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性机理提供依据。【方法】利用叶片药膜法测定不同小菜蛾种群3龄幼虫对氯虫苯甲酰的抗性水平,通过转录组测序、insectbase数据库和小菜蛾基因组数据库筛选得到52个细胞色素P450基因。应用MEGA5.10软件对52个细胞色素P450基因进行进化分析,获得与抗药性密切相关的CYP3和CYP4家族P450基因。利用实时荧光定量PCR方法分析目的基因在小菜蛾室内筛选种群（HZY）和田间抗性种群惠州种群（HZ）、连州种群（LZ）、东升种群（DS）、钟落潭种群（ZLT）中的表达量,选用RNA干扰技术,采用注射法,验证在抗性种群中显著上调表达的CYP6BF1V4在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的功能。【结果】抗药性测定结果表明,LZ和HZ小菜蛾种群为中等水平抗性,ZLT、DS和HZY小菜蛾种群为高水平抗性。对52个细胞色素P450基因的系统发育树分析发现,小菜蛾拥有10个CYP4家族基因,28个CYP3家族基因,其中2个CYP4家族基因在HZ和HZY种群中的表达量显著高于敏感种群,4个CYP3家族基因表达量与小菜蛾抗性呈正相关,8个基因在中等水平抗性小菜蛾体内的表达量高于在高水平抗性小菜蛾体内的表达量。对田间种群进一步筛选得到6个与小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺密切相关,在不同抗性种群中均上调表达的细胞色素P450基因,其中4个为CYP6家族基因（CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1和CYP6B6）,2个为CYP9家族基因（CYP9G2.1和CYP9G2.2）,以CYP6BF1V4的表达量最高,其在抗性种群中的表达量是在敏感种群中表达量的3.5—6.3倍。RNA干扰结果显示,沉默CYP6BF1V4能够显著提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感性。【结论】CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1、CYP6B6、CYP9G2.1和CYP9G2.2可能在小菜蛾体内协同调控多功能氧化酶的表达,从而加快小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的速度,提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。