基因枪法介导的转KN2基因小麦的获得及鉴定

【目的】获得转KN2基因的小麦植株,为研究KN2基因对提高转基因小麦抗寒性的作用,以及为利用基因工程提高小麦抗逆性奠定基础。【方法】以弱冬性小麦品种小偃22为供试材料,通过基因枪法,用含有KN2基因的植物表达载体和筛选标记基因bar共转化小麦幼胚愈伤组织,经过除草剂(Phosphinothricin,草丁膦)筛选和愈伤组织分化获得再生植株,并对得到的再生小麦植株进行PCR检测。【结果】采用基因枪法共轰击小偃22的幼胚愈伤组织1 680个,共获得再生植株17株,移栽到花盆中成活15株;根据目标基因序列设计特异引物,对成活的小麦植株进行PCR检测,结果表明获得含有bar基因和KN2基因的转基因阳性植株分别为6株和4株,转化率分别为0.36%和0.24%,bar和KN2的共转化率为0.24%。【结论】KN2基因成功地转入到小麦品种小偃22中。     

用基因枪法将Bt杀虫基因导入玉米自交系的研究

利用PDSl000／氦气基因枪将人工合成的Bt基因导入玉米自交系340,8902,吉853,Mo17等的愈伤组织,在含有除草剂Basta2～5mg／L的培养基上筛选与分化。经3轮的除草剂筛选获得1840块抗性愈伤组织。再生860个植株。Southern blot分析证明,3个植株中整合有成基因。     

基因枪法获得GNA转基因小麦植株的研究

 以小麦品种京 411作为基因枪转化的靶材料 ,取其未成熟胚诱导愈伤组织 ,经过 10 d左右培养后 ,用含有雪花莲凝集素 (Galanthus nivalis agglutinin ,GNA)和 bar基因的质粒 p BI12 1- 2轰击 80 0个胚性愈伤组织 ,在含有4mg/ L Basta溶液的培养基上进行筛选 ,分化及生根培养 ,获得 6 7棵再生植株。田间涂抹 Basta溶液 (5 0、75 m g/ L)检测和接麦蚜实验 ,提取转基因植株基因组 DNA,用扩增 GNA基因的引物经 PCR扩增 Southern杂交 ,结果表明利用基因枪转化已从 T2 代获得了 8株含有编码 bar/ GNA基因的转基因植株。     

小麦WZY2基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株。     

苜蓿转LEA_3基因研究

以苜蓿(Medicago sativa)品种中苜一号为试材,进行愈伤组织的诱导。通过基因枪法将来源于大麦的胚胎发生丰富蛋白基因lea3导入愈伤组织细胞,于8 mg/L PPT的选择压力下筛选2个月,获得了抗性愈伤组织及再生植株,并将再生植株再次转入含有PPT的诱导继代培养基中进行筛选。通过PCR检测,在21株再生植株中有2株扩增出了目的基因片段。证实lea3基因已导入了苜蓿细胞中,并表达。     

商陆抗病毒蛋白基因导入玉米幼胚愈伤组织研究初报

以87-1自交系,87-1×综3,郑22×87-1,郑22×HI(A×B)4个基因型的玉米幼胚愈伤组织为受体,利用基因枪介导法将商陆抗病毒蛋白(PAP)基因和抗卡那霉素筛选基因以共转化的方式导入玉米胚性愈伤组织,然后在含有25～40 mg@L-1G 418培养基上筛选愈伤组织并分化得到再生植株.PCR和Southern杂交结果表明,PAP基因已经转入由抗性愈伤组织再生出的玉米植株中.     

基因枪介导的转PYL5基因小麦的获得与鉴定

【目的】通过基因枪介导共转化,获得转拟南芥抗旱基因PYL5的小麦植株,为转基因小麦的抗旱功能研究奠定基础。【方法】以小麦品种西农889、绵阳19和宁春16为供试材料,通过基因枪介导法将诱导型启动子Rd29A启动的PYL5基因和筛选标记基因Bar共转化到小麦幼胚愈伤组织中,经过除草剂PPT(Phosphinothricin)筛选和愈伤组织分化,获得再生植株。根据目标基因PYL5和Bar基因序列分别设计特异引物,对移栽成活的小麦T0代再生植株进行基因特异性PCR检测。【结果】采用基因枪分别轰击西农889的1800个、绵阳19的800个和宁春16的800个幼胚愈伤组织,经过筛选和分化分别获得了9,5和14株小麦再生植株;对转基因小麦T0代再生植株的基因特异性PCR检测结果表明,西农889、绵阳19和宁春16 Bar基因的转化率分别为0.280%,0.500%和0.750%,PYL5基因的转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%,Bar和PYL5基因的共转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%。【结论】PYL5基因成功转入到了小麦品种西农889、绵阳19和宁春16中。     

应用电激法将外源基因导入小麦的研究

建立了以小麦成熟胚为植体的组织培养系统。应用电激仪ＨＰＥＳ－３，摸索了适合小麦种胚外源基因转化的电激条件，并以含有潮霉素磷酸转移酶基因的质粒ｐＬＣＮ１０５５ＤＮＡ直接对萌动的小麦种胚进行电激转化，在含有潮霉素的小麦愈伤组织培养基中培养，获得了假定的转基因愈伤组织。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交初步证明ＨＰＴ基因已整合至小麦愈伤组织的基因组中，将这些转基因愈伤组织培养成苗还在试验之中。     

菜豆几丁质酶基因转化小麦的研究

利用农杆菌二元载体转化法和花粉管通道法 ,以菜豆几丁质酶基因转化小麦东农 774 2。农杆菌感染后的愈伤组织以 G4 183 0 mg· L-1筛选 5周 ,经 PCR和 PCR- Southern杂交检测 ,有0 .3 8%的愈伤获得转化。花粉管通道法转化小麦共操作小花 3 85朵 ,其中有 68.3 0 %的小花结实 ,经 PCR和 PCR- Southern杂交检测 ,获得转基因植株的转化频率为 0 .52 %。     

农杆菌介导法获得草地早熟禾转Bt基因植株

以草地早熟禾品种超级伊克利成熟种子为外植体材料,当愈伤组织诱导培养基中琼脂的用量增加至16g/L时,诱导产生的颗粒状胚性愈伤组织占愈伤组织总数的40%以上。愈伤组织经携带pGBI4AB农杆菌LBA4404的感染和共培养后,在继代培养基上添加50mg/L筛选剂G418,可较好地筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,进而获得具有卡那霉素抗性的再生植株。PCR分子检测结果表明,Bt基因已导入转化植株。生物学抗虫性鉴定结果显示,转Bt基因当代植株对1～2龄棉铃虫具有不同程度的抗性。     

Study on the Obtaining of Transgenic Wheat with GNA Alien Gene by Biolistic Particle

The immature embryos of wheat plants, cv. Jing 411, 12 - 14 days after pollination, were cultured on SD2 medium for callus induction. After 10 days culture, 800 wheat calli were bombarded by biolistic particle coated with theDNA of plasmid pBI121-2 harboring both Galanthus nivalis agglutinin gene and bar gene. 67 green plants were finally regenerated from the bombardment calli on selection medium containing 4mg/L Basta. The results of bioassay by both inoculating wheat aphids onto the plants and applying Basta solution of 50 mg/L and 75 mg/L onto the wheat leaves in the field, and the molecular analysis, such as PCR and Southern blotting, indicated that 8 T2 plants contaning the target genes were obtained.     

农杆菌介导的PEPCase基因导入小麦的初步研究

利用根癌农杆菌遗传转化系统,以普通小麦扬麦158为材料,将玉米泛生素基因启动子(Ubi)驱动下的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因,以及潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)导入预培养10~12 d小麦胚性愈伤组织中。经过在含100~150 mg.L-1潮霉素(hyg)的筛选培养基上连续筛选,获得了hyg抗性植株。经GUS组织化学染色检测和PCR鉴定,其中的9棵含有Ecppc基因,PCR阳性植株比例为3.03%。初步鉴定已成功地建立了小麦遗传转化系统,为进一步探讨PEPCase基因在植物中的转化和表达奠定了基础。     

低能氩离子束介导将绿色荧光蛋白基因导入小麦的研究

用低能氩离子束介导将改良的绿色荧光蛋白基因（ｍＧＦＰ４）导入小麦栽培品种皖９２１０和皖麦３２号的成熟胚细胞。在含有１００￣１４０ｍ／Ｌ巴龙霉素培养基上继代培养后,获得了一批抗性愈伤组织。经过分化培养,皖９２１０获得５株再生苗,皖麦３２号获得３２株绿苗,对照的２００枚成熟胚未获得再生苗。对再生苗进行ＰＣＲ检测,均扩增出６００ｂｐ的ｎｐｔⅡ基因片段。取４株长势好的绿苗进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,结果     

小麦导入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）基因的初步研究

[目的]将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）基因导入普通小麦临优145。[方法]利用根癌农杆菌遗传转化系统,以普通小麦临优145为材料,将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）基因,导入小麦胚性愈伤组织中,用含潮霉素（hyg）的筛选培养基连续筛选,并从分子水平上检测该基因。[结果]获得了hyg抗性植株,经GUS组织化学染色检测表明,抗性苗叶片被染成了深蓝色;PCR检测出目标条带。[结论]初步证明磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）基因已经导入受体材料中。     

小麦成熟胚再生体系及基因枪转化的初步研究

以小麦品种晋麦2148的成熟胚为外植体,消毒后用解剖刀刨碎,接种于MS+VB5+11.2g·L-1葡萄糖+2mg·L-12,4D+8g·L-1琼脂糖的培养基中诱导愈伤组织,将诱导3周的成熟胚愈伤组织接种到胚状体成熟培养基(MS+VB5+11.2g·L-1葡萄糖+0.2mg·L-1IAA+8g·L-1琼脂糖)中培养4-8周,然后转接到再生培养基(1/2MS+VB5+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂糖)中进行再生成苗.接种1200块成熟胚,得到1123块愈伤组织,最终形成258株再生苗,再生率为21.5%.在建立了再生体系的基础上,用基因枪介导法将GUS基因导入成熟胚愈伤组织,Xgluc染色表明,GUS基因已经在小麦成熟胚愈伤组织中表达.将100块愈伤组织用Xgluc染色,29块愈伤组织出现肉眼可见的蓝色小点.     

以nptⅡ为选择标记基因的转基因小麦高效筛选方法

采用两种方法筛选以npⅡt为选择标记基因的转基因小麦植株,结果表明,由未成熟种子获得的植株在无菌条件下进行卡那霉素筛选时（A方法）,50 mg/L的卡那霉素能有效抑制非转化小麦幼苗的正常生长;由成熟种子自然发芽获得的植株在滤纸上进行卡那霉素滴注筛选时（常规方法,B方法）,80～100 mg/L的卡那霉素能较好地抑制非转化小麦幼苗的正常生长。相对于B方法的常规筛选方法,A方法具有材料对卡那霉素敏感性高、筛选周期短而且筛选结果可靠性高等优点,是一种高效的以npⅡt为选择标记基因的转基因小麦的筛选方法。     

小麦Ta-hir2基因克隆及转Ta-hir2基因小麦的获得

通过基因枪介导法将小麦过敏性诱导反应蛋白2基因Ta-hir2转入小麦胚性愈伤组织中,经分化筛选后获得转基因小麦植株,为验证该基因的功能奠定基础.以接种非亲和叶锈菌小种05-19-43②的小麦‘TcLr15,为材料,采用同源克隆的策略克隆了小麦Ta-hir2基因;将该基因的编码区与植物表达载体pAHC-25相连,成功构建...     

小麦成熟胚高频再生基因型筛选及再生体系研究

以目前生产上主栽或主推的、具有优良农艺性状的18个黄淮麦区冬小麦品种(系)和2个西北春麦区春小麦品种为材料,对它们成熟胚再生能力进行比较,从中筛选出再生频率高的基因型,并探讨不同接种方法、麦草畏质量浓度、细胞分裂素和干燥处理等对小麦成熟胚愈伤组织诱导和分化频率的影响。结果表明,小麦成熟胚愈伤组织诱导率普遍较高,为66.7%～100.0%,而分化率普遍较低,为3.6%～35.8%。基因型间差异显著,其中愈伤组织分化率较高的基因型有泛麦8号、周麦27和邢麦6号,绿苗分化率超过30%;采用胚十字形切割法接种小麦成熟胚愈伤组织分化率较高,达到54.5%～73.3%;诱导培养基中麦草畏的诱导效果显著优于2,4-D。在麦草畏质量浓度为2～4mg/L时有利于愈伤组织诱导和分化;成熟胚愈伤组织转入不含激素或含有2mg/L 6-BA或KT的分化培养基中时,分化率分别达到38.5%,45.8%和37.0%,较其他细胞分裂素和质量浓度处理分化率高,而愈伤组织分化前干燥处理6h和未干燥处理的差异不显著,干燥12h分化率明显降低。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。