甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的外源表达及酶活力测定

【目的】为了研究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶Se CDA2a的酶学性质,探索其对甜菜夜蛾幼虫发育过程的影响,为甜菜夜蛾的生物防治提供新靶标.【方法】以p MD19GTGSecda2a重组质粒为模板,PCR扩增得到SecG da2a基因.构建原核表达载体p ETG28aGSecda2a,IPTG诱导蛋白表达.利用BacGtoGBac杆状病毒表达系统,构建重组转座载体p Fast Bc Ha T AGSecda2a,脂质体转染昆虫细胞Sf9,Westernblot对Se CDA2a重组蛋白进行分析,以对硝基苯胺为底物利用分光光度计测定其酶活力.【结果】Secda2a在大肠杆菌和Sf9中均成功表达61k Da的重组蛋白,与预测分子量大小相符.IPTG终浓度为0.50mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高.昆虫细胞Sf9表达的重组蛋白Se CDA2a的酶活力是1.57U/m L.【结论】本研究实现甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因Secda2a的外源表达,测定重组蛋白Se CDA2a的酶活力.     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的外源表达及酶活力测定

【目的】为了研究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶Se CDA2a的酶学性质,探索其对甜菜夜蛾幼虫发育过程的影响,为甜菜夜蛾的生物防治提供新靶标.【方法】以p MD19GTGSecda2a重组质粒为模板,PCR扩增得到SecG da2a基因.构建原核表达载体p ETG28aGSecda2a,IPTG诱导蛋白表达.利用BacGtoGBac杆状病毒表达系统,构建重组转座载体p Fast Bc Ha T AGSecda2a,脂质体转染昆虫细胞Sf9,Westernblot对Se CDA2a重组蛋白进行分析,以对硝基苯胺为底物利用分光光度计测定其酶活力.【结果】Secda2a在大肠杆菌和Sf9中均成功表达61k Da的重组蛋白,与预测分子量大小相符.IPTG终浓度为0.50mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高.昆虫细胞Sf9表达的重组蛋白Se CDA2a的酶活力是1.57U/m L.【结论】本研究实现甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因Secda2a的外源表达,测定重组蛋白Se CDA2a的酶活力.     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的外源表达及酶活力测定

【目的】为了研究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的酶学性质,探索其对甜菜夜蛾幼虫发育过程的影响,为甜菜夜蛾的生物防治提供新靶标。【方法】以pMD19-T-Secda2a重组质粒为模板,PCR扩增得到Secda2a基因。构建原核表达载体pET-28a-Secda2a,IPTG诱导蛋白表达。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建重组转座载体pFastBac HT A-Secda2a,脂质体转染昆虫细胞Sf9,Western blot对SeCDA2a重组蛋白进行分析,以对硝基苯胺为底物利用分光光度计测定其酶活力。【结果】Secda2a在大肠杆菌和Sf9中均成功表达61kDa的重组蛋白,与预测分子量大小相符。IPTG终浓度为0.50mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高。昆虫细胞Sf9表达的重组蛋白SeCDA2a的酶活力是1.57U/mL。【结论】本研究实现甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因Secda2a的外源表达,测定重组蛋白SeCDA2a的酶活力。     

小地老虎几丁质脱乙酰基酶基因的克隆与原核表达

几丁质脱乙酰基酶(Chitin deacetylase,CDA)可以将几丁质修饰为壳聚糖,在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。研究以小地老虎(Agrotis ipsilonHufngel)5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到小地老虎几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA序列。该序列含有2 048个碱基,包括一个1 626个碱基的开放读码框,编码541个氨基酸,分子质量约为61.7 ku,多肽的等电点为5.03。推导得到的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰基酶高度同源。所获小地老虎CDA基因的cDNA序列已登录GenBank并获得登录号,登录号为JQ012932。将CDA基因连接到PET21b载体上转入到BL21中诱导表达,SDS-PAGE电泳得到目的蛋白条带。     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因(secda 5)的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA,EC 3.5.1.41)是昆虫几丁质代谢中的一种关键酶,在昆虫生长、发育和代谢中具有重要作用.本研究旨在克隆甜菜夜蛾secda5基因,对其进行原核表达,同时制备其蛋白的多克隆抗体.[方法]以pMD19-T-secda5重组质粒为模板,通过PCR技术获得编码甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠几丁质脱乙酰酶secda5全长基因,连接pET-28a载体并转化E.coli BL21 (DE3)构建工程菌.以不同IPTG浓度、培养温度对目的蛋白进行诱导表达.[结果]IPTG终浓度为0.50 mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高.诱导表达获得的重组蛋白经纯化后制备多克隆抗体.[结论]此研究成功克隆了甜菜夜蛾secda 5基因,并进行了原核表达以及多克隆抗体的制备.     

蜜蜂螺原体几丁质脱乙酰酶基因的克隆、表达及酶学性质

[目的]通过表达载体p ET-28a(+)在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因chid,并测定其部分酶学性质,为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。[方法]利用Overlap Extension PCR(OE-PCR)定点突变技术,在引物设计时插入目的突变,通过3次PCR获得突变后的目的片段,测序验证后构建重组质粒p ETchid,挑取BLchid表达菌株。IPTG诱导表达目的蛋白,NTA-Ni2+柱纯化,Western blotting验证,紫外分光光度法测定其酶活力和酶学性质。[结果]DNA测序结果表明:chid基因中待突变位点已由TGA突变为TGG,成功克隆到chid基因全长,并得到外源表达的完整目的蛋白。该基因编码区为672 bp,编码的氨基酸构成相对分子质量约28×103的蛋白,同源性比较发现其与S.melliferum KC3/BC3/IPMB4A菌株序列相似性为97%。测得外源表达的该酶活力最高可达10.14 U·m L-1,最适温度为50℃左右,最适p H值为7.0~7.5。[结论]首次克隆了螺原体几丁质脱乙酰酶基因chid,并得到具有活性的外源目的蛋白,为后续研究螺原体与宿主蜜蜂的相互作用及其致病机制提供了重要信息。     

中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因的分子特性和生物学功能

【目的】研究中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase,CDA）基因的分子特性和生物学功能,为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】采用生物信息学方法在稻蝗转录组数据库中搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列,对其进行保守区域分析,选取赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、果蝇（Drosophila melanogaster）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、家蚕（Bombyx mori）和云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）等昆虫物种的同源序列与中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列进行聚类分析,进一步构建系统发育树;运用real-time PCR方法检测几丁质脱乙酰基酶基因在中华稻蝗5龄若虫不同组织部位和不同发育天数表皮中的表达特性;进一步采用RNA干扰（RNAi）技术研究该基因对中华稻蝗蜕皮发育的影响。【结果】在中华稻蝗转录组数据库中搜索获得2条几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA全长序列,生物学软件分析其氨基酸,发现2条序列均具有信号肽,开放阅读框包含3个几丁质脱乙酰基酶保守区域：几丁质结合区（ChBD）、低密度脂蛋白受体区（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化结合域（CDA）。聚类分析表明2条序列分别与所选用的5种昆虫CDA2聚为一支。剪切子聚类分析发现2条序列分别与5种昆虫CDA2a和CDA2b相聚为一支,综合序列分析和聚类结果,认为所获得的序列属于几丁质脱乙酰基酶2基因的2个不同剪切子,分别命名为OcCDA2a和OcCDA2b。定量PCR分析表明OcCDA2a和OcCDA2b均在中华稻蝗表皮、前肠和后肠中高表达;在5龄第1天的表皮中表达量较高,之后逐步下降,蜕皮前又略有上升;RNAi研究发现5龄第2天的若虫注射dsOcCDA2a或dsOcCDA2b 24 h后,与注射dsGFP的对照相比,目的基因表达量显著降低,沉默效率分别为96.72%和80.43%;进一步观察试虫的表型,与对照组相比,注射dsOcCDA2和dsOcCDA2a的大多数虫体出现龄期延长,脊线开裂,旧表皮不能顺利剥离而导致虫体扭曲,最终死亡。少数若虫在蜕皮前死亡,未出现异常表型,部分若虫虽蜕至成虫,但四肢无力,行动缓慢。死亡率分别达到87.5%和94.4%;注射dsOcCDA2b的试虫无可见表型,可正常蜕皮发育至成虫。【结论】中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因具有2个剪切子,分别为OcCDA2a和OcCDA2b。OcCDA2a参与虫体蜕皮,对其生长发育起着重要的作用,该基因的沉默导致中华稻蝗因蜕皮困难而死亡,而OcCDA2b对中华稻蝗的生长发育没有影响。     

总状毛霉甲壳素脱乙酰酶(CDA2)全长cDNA的克隆及原核表达

采用快速扩增cDNA末端(RACE)克隆技术,通过设计甲壳素脱乙酰酶简并引物,从总状毛霉Mucor racemosus菌丝体中克隆了CDA2的基因(EF468349)及其全长cDNA(DQ678929)序列。与已获得的总状毛霉菌 cda1基因相比, cda2基因中不含内含子。总状毛霉 cda2全长cDNA为1 378 bp,包含23-bp 5’端非翻译区、1 254 bp开放阅读框和101-bp 3’端非翻译区,编码一条由418个氨基酸残基组成的多肽链,其N端包含一段21个氨基酸残基组成的信号肽,在150～272氨基酸残基区存在一个多糖脱乙酰酶保守结构域。通过构建pET28a-cda2表达载体和进行原核表达研究,结果显示：原核表达产生的重组蛋白CDA2的分子量约为46 ku,表达形式以包涵体为主,纯化获得的重组蛋白CDA2具有甲壳素脱乙酰酶催化活性。本研究为进一步研究总状毛霉CDA2的结构和功能奠定了基础。     

重组酶Xar的表达纯化及性质研究

为获得高效的半纤维素类饲料酶制剂,将含嗜热厌氧乙醇菌α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶(Xar)基因的重组质粒p ET-20b-xar导入大肠杆菌DH10B中,经IPTG诱导进行高效表达,将表达的重组酶进行热处理和Ni~(2+)亲和层析纯化,并对纯化的重组酶Xar的性质进行研究。结果表明,以对硝基苯酚-α-阿拉伯呋喃糖苷(p NPAF)为底物,重组酶Xar的最适反应温度和最适p H值分别是75~80℃和6.0,米氏常数(Km)、最大反应速度(Vmax)分别为2.42 mmol/L、20.7μmol/(min·mg);以对硝基苯酚-β-木糖苷(p NPX)为底物,重组酶Xar的最适反应温度和最适p H值分别为93℃和5.8~6.2,Km、Vmax值分别为0.60 mmol/L、43.8μmol/(min·mg)。将重组酶Xar置于80℃保温1 h,木糖苷酶的相对活性仍为56.4%,在p H值4.2~8.2条件下仍保持较高的稳定性。当木糖浓度达到400 mmol/L时,木糖苷酶的相对活性仍有97.9%。Mn~(2+)对重组酶Xar有明显的激活作用,而Cu~(2+)和Zn~(2+)对其有明显的抑制作用。可见,重组酶Xar具有良好的热稳定性。     

飞蝗几丁质脱乙酰基酶的真核表达、亲和纯化及酶活性

【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDAs重组质粒,转化获得Bacmid重组质粒后,转染至昆虫Sf9细胞进行目的蛋白的体外表达。采用Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱和阴离子(Q-Sepharose)交换层析柱对蛋白产物进行纯化。12%SDS-PAGE检测蛋白纯度后,采用分光光度法以对硝基乙酰苯胺为底物检测目的蛋白的酶活性,T检验法对LmCDA2a和LmCDA2b酶活力进行差异显著性分析。【结果】BLASTP和SMART软件预测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4个结构域:N-端信号肽(signal peptide)、几丁质结合域(chitin binding peritrophin-A,Ch BD)、A型低密度脂蛋白受体结构域(low-density lipoprotein receptor class A,LDLa)和脱乙酰基酶催化结构域(catalytic domain,CDA)。3个基因的几丁质结合域中均包含6个保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b两个剪切子除在其第3个半胱氨酸和第4个半胱氨酸之间(67—84 aa)的氨基酸数目和组成及在第4和第6个半胱氨酸(84—106 aa)之间的序列存在差异外,其余部分完全一致。Western blot结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量约为61 k D左右,与预测的蛋白分子量大小一致,表明Bacmid重组质粒在昆虫Sf9细胞中成功表达。采用12%SDS-PAGE胶电泳对各蛋白纯化组分进行检测,结果显示Ni-NTA亲和层析柱可将大部分杂蛋白洗脱,而Q-Sepharose交换层析柱可对蛋白进行更彻底地纯化。酶活检测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354、0.228 U·μL~(-1),并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在显著差异。【结论】体外真核表达LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并进行酶活测定后发现三者均具有几丁质脱乙酰基酶活力,且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有显著性差异,推测前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分别出现不同飞蝗表型的原因可能是由于它们酶活力存在显著性差异。     

家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析

【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃。测定BmALP的Km值为1.40 mmol·L~(-1)。在10℃处理2 h后,BmALP的残余活性最高;35℃处理2 h后,其活性完全丧失。Mg2+和Zn2+促进了BmALP催化反应的进行,其最适浓度分别为40和5 mmol·L~(-1)。在20 mmol·L~(-1)浓度范围内,Cu2+激活了BmALP活性,其中10 mmol·L~(-1)时激活效果最好,浓度超过20 mmol·L~(-1)时,Cu2+则抑制了BmALP活性。【结论】克隆了家蚕碱性磷酸酶基因BmALP,表达纯化了BmALP蛋白并分析了其结构和性质,为深入研究其结构和功能打下了基础。     

利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统（split-ubiquitin yeast membrane system）,以小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）的外壳蛋白（CP）基因为诱饵对异沙叶蝉（Psammotettix alienus L.）cDNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds cDNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到pPR3-N文库载体上,构建得到以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选pPR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology（GO）注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×10⁶ cfu,文库实际扩增数量大于1.3×10⁶ cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉cDNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L^-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库,这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库的成功构建与筛选,为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。     

飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达及酶学特性分析

【目的】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析,探究该酶在飞蝗(Locusta migratoria)生长发育过程中的生物学功能,为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据Lm NAG1的cDNA全长序列(Gen Bank:JX888720.1)设计包含酶切位点Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ和6×His标签的引物。采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段,双酶切后连接至pFast Bac~(TM)-Dual载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上,用蓝白斑结合抗生素筛选。挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带,挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid,Bacmid)。用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9中,72 h内连续观察细胞形态,当出现感染迹象后收集细胞,离心,取上清得到P1代重组病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞,裂解并提取蛋白,Western blot检测目的蛋白是否成功表达。之后大量感染Sf9细胞,提取蛋白,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化,取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度。采用4MU-GlcNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定。【结果】克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全长的pFast Bac-LmNAG1重组质粒,酶切验证与目标条带一致。将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,PCR扩增挑选出纯白斑,成功将LmNAG1全长序列构建到杆状病毒基因组上。将重组Bacmid转染至Sf9细胞,72 h后在显微镜下观察可见细胞膨大,边缘不规则等感染迹象。离心收集重组病毒粒子感染新的Sf9细胞,72 h后收集细胞,Western blot检测发现在67 kD附近有明显条带,与LmNAG1的理论分子量一致,获得带6×His标签的融合蛋白。大量感染收集细胞提取蛋白,经Ni-NTA琼脂糖层析纯化,进一步透析除盐后用阴离子交换柱Q二次纯化,得到了高纯度的目的蛋白。用Bradford法测定最纯的E3组分的蛋白浓度为0.057μg·μL~(-1)。体外活性测定结果表明LmNAG1的最适pH为8.0,且在pH 6.0—8.0范围内具有较高的稳定性;LmNAG1的最适温度为40℃,在40℃以下具有很高的稳定性,当温度高于45℃时热稳定性迅速下降;采用4MU-GlcNAc为底物测得LmNAG1具有水解β-1,4糖苷键的活性,可以释放出4MU,它的动力学参数K_m值为(0.28±0.02)mmol·L~(-1),K_(cat)值为(902.88±38.15)s~(-1)。【结论】成功获得高纯度且具活性的LmNAG1蛋白,其可水解β-1,4糖苷键连接的几丁质寡糖,与已知昆虫NAG1具有相似的生物学功能,即参与几丁质的降解。     

桃小食心虫鱼尼丁受体基因克隆及表达模式分析

【目的】二酰胺类杀虫剂的作用靶标鱼尼丁受体（ryanodine receptor, RyR）是目前所知的最大的离子通道蛋白,该受体可控制细胞内Ca²⁺的释放,对细胞内Ca²⁺的稳定起着关键作用。克隆获得桃小食心虫鱼尼丁受体基因（CsRyR）全长序列,进一步解析该基因在桃小食心虫(Carposina sasakii)各发育阶段的表达模式。【方法】通过同源序列比对的方法,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、功能结构域等信息进行预测分析,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,明确其系统进化关系。分别提取桃小食心虫各发育阶段RNA,以GAPDH为内参基因,应用RT-qPCR技术,解析CsRyR在桃小食心虫各发育阶段（卵、幼虫、蛹和成虫）的表达模式。【结果】桃小食心虫CsRyR的cDNA全序列长度为15 766 bp,开放阅读框15 405 bp,编码5 134个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示,CsRyR与脊椎动物RyRs的一致度分别为45%-47%;与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）RyR的一致度也为46%。在昆虫RyRs中,与鳞翅目一致度为91%-94%,与同翅目、双翅目昆虫一致度均为79%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与鳞翅目夜蛾科和螟蛾科害虫RyRs亲缘关系最近。结构域分析结果显示,CsRyR具有RyR的典型结构域,如位于C-末端的6个跨膜结构域（AA 4 467-5 029）、释放Ca²⁺的通道形成基序GVRAGGGIGD、Ca²⁺结合位点EF-hand和3个ATP结合位点GXGXXG等。二酰胺类杀虫剂可能的作用位点AA 183-290（BmRyR）,AA 4 610-4 655（DmRyR）和4 946G（PxRyR）在CsRyR中无特殊性。此外,CsRyR中存在AA 2 490- 2 496 TQAPRPG和5 131-5 134 SQAK两个基序,在其他物种中均没有发现。RT-qPCR分析结果表明,CsRyR在蛹期表达量最高,分别是1日龄卵、6日龄卵、初孵幼虫、老熟幼虫和成虫的25.19、7.73、6.48、4.74和3.58倍。【结论】克隆了CsRyR基因全长cDNA序列,证明其表达具有发育阶段特异性。     

橡胶树白粉病菌OhPbs2的克隆及功能分析

【目的】Pbs2是MAPK信号途径HOG-MAPK通路的重要成员之一,在植物病原菌渗透压调节方面发挥着重要作用。橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)是专性寄生菌,论文借助橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),研究橡胶树白粉病菌OhPbs2的功能。【方法】采用同源克隆方法,分别以橡胶树白粉病菌基因组DNA和c DNA为模板,PCR扩增OhPbs2;利用生物信息学分析该基因的结构域,对该基因和其他真菌的7个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用MEGA6中最大简约法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;利用同源重组和原生质体转化技术,将OhPbs2转化到缺失Pbs2的橡胶树炭疽菌突变体ΔCgPbs2中;在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇的平板上筛选转化子,同时提取转化子的基因组作为模板,用橡胶树白粉病菌OhPbs2的引物对进行PCR鉴定,选择正确的转化子ΔCgPbs2+OhPbs2进行后续表型测定;在不同培养条件下,比较ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和野生型菌株生长状态,并在橡胶树叶片接菌检测3个菌株致病力。【结果】OhPbs2基因序列全长1 927 bp,c DNA序列全长1 860 bp,含有一个内含子,编码一个619个氨基酸的蛋白;生物信息学分析表明该蛋白具有与Cg Pbs2相同的S_TKc功能域,构建系统进化树发现橡胶树白粉病菌Pbs2蛋白与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Pbs2蛋白亲缘关系最近,相似度为55%,与橡胶树炭疽病菌的相似度为49%,与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的Pbs2蛋白具有较近的亲缘关系,相似度分别为54%、53%、53%、50%;ΔCgPbs2+OhPbs2菌株能在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇培养基上长出白色菌落,ΔCgPbs2菌株不能生长,并且测序结果显示OhPbs2已成功转入ΔCgPbs2;ΔCgPbs2+OhPbs2在MM培养基上菌落呈白色,气生菌丝较短,不同于wild type菌株。在含有不同浓度Na Cl、山梨醇、SDS、H2O2及咯菌腈的MM培养基上,ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和wild type菌株随着浓度增加,菌落生长速度逐渐降低,OhPbs2不仅能恢复橡胶树炭疽菌菌株耐渗透压尤其耐受山梨醇的能力以及对咯菌腈的敏感性,甚至具有增强的能力,OhPbs2互补改变了橡胶树炭疽病菌颜色,抑制了气生菌丝生长;Cg Pbs2可能参与了橡胶树炭疽病菌致病性,但OhPbs2互补没有恢复其致病性。【结论】OhPbs2可能参与调控病菌的营养生长、氧化应激反应、渗透压响应及细胞壁形成等,并能增强橡胶树炭疽病菌相应功能,但与Cg Pbs2调控病菌致病力的机制可能存在不同。     

苹果蠹蛾几丁质脱乙酰基酶2的基因克隆、表达模式和分子特性

【目的】研究苹果蠹蛾（Cydia pomonella）几丁质脱乙酰基酶2（chitin deacetylase 2,CDA2）的分子特性和表达模式,为新型杀虫剂靶标筛选提供理论依据。【方法】基于苹果蠹蛾转录组和基因组数据,通过同源比对获得苹果蠹蛾CDA2的相关信息;新鉴定的CpCDA2a和CpCDA2b与其他昆虫中已鉴定的CDA2氨基酸序列进行多序列比对,并采用MEGA7软件邻接法（neighbor-joining,NJ）构建系统发育树;通过生物信息软件预测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体的蛋白功能域和三维结构并分析其差异,并通过在线软件对其分子量、等电点和亲/疏水性等蛋白理化性质及糖基化修饰位点等方面进行分析比较;采用荧光定量PCR检测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体在苹果蠹蛾不同发育时期及其幼虫不同组织的表达情况,以及注射蜕皮激素后其表达量的变化趋势。【结果】获得了苹果蠹蛾CDA2的两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b的全长CDS序列及其内含子和外显子位置信息;分析发现两个剪切体的蛋白序列均具有信号肽、几丁质结合域（ChBD）、低密度脂蛋白受体域（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化域（CDA）等功能域。多序列比对和聚类分析结果表明,不同昆虫间CDA2差异剪切类型非常类似,相同目昆虫的序列以较高的置信度聚为一支。三维结构模拟与比较发现两个剪切体的ChBD功能域在结构上存在较大差异;理化性质分析显示两个剪切体的亲/疏水性和糖基化位点也存在差异。不同发育时期表达量分析表明,CpCDA2a主要在幼虫期高表达,CpCDA2b主要在蛹的前期和中期高表达,而且在幼虫蜕皮前和蜕皮后CpCDA2a和CpCDA2b表达量均会显著上调;不同组织的表达量分析表明,CpCDA2a和CpCDA2b均在表皮中表达量最高,而CpCDA2b在头部的表达量也较高。对注射蜕皮激素后幼虫中CpCDA2a和CpCDA2b表达量分析显示,与对照相比在注射蜕皮激素后CpCDA2a的表达量在24 h和48 h均有所上调,但差异不显著,而CpCDA2b在24 h和48 h均显著上调。【结论】苹果蠹蛾CDA2的转录本存在两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b,根据对其分子特性、发育阶段和组织表达谱、以及注射蜕皮激素后表达动态等方面的综合分析,推测两者均参与苹果蠹蛾蜕皮和新表皮形成过程,但由于可变剪切的序列差异导致的蛋白结构和理化性质上的差异造成了两者在功能上的分化。     

GmHMADP参与高温高湿下大豆种子活力形成及铜镉胁迫响应的研究

【目的】高温高湿、重金属等非生物胁迫是制约大豆生产,影响种子发育和品质的重要因素。通过对大豆GmHMADP的研究,揭示其在重金属镉、铜和高温高湿胁迫下的表达水平以及功能,以期为培育高活力的逆境耐受性大豆新品种提供理论依据和实践基础。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计引物,以宁镇1号和湘豆3号2个品种叶片的cDNA为模板,分离大豆GmHMADP全长cDNA序列。通过NCBI网站BLAST对GmHMADP同源性氨基酸序列进行搜索,并用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对。同时,以XhoⅠ和SalⅠ为酶切位点构建35S::GmHMADP-GFP融合表达载体,分析其在烟草叶肉细胞的瞬时表达,进行亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术对GmHMADP的组织特异性表达及其在高温高湿和CuSO₄、CdCl₂处理下的表达进行分析。以XbaⅠ和BamHⅠ为酶切位点,利用pBI121载体,构建融合表达载体,将GmHMADP在野生型拟南芥中过表达,获得3个纯合的T3转基因株系,对高温高湿胁迫下拟南芥的种子活力以及过表达拟南芥植株对铜、镉胁迫的耐受性进行分析。【结果】获得大豆GmHMADP全长cDNA序列,该基因包含1个996 bp的完整开放阅读框,具有4个外显子和3个内含子。多序列比对结果表明,GmHMADP氨基酸序列含有2个金属离子结合位点特征序列CXXC。亚细胞定位结果表明GmHMADP蛋白定位于细胞膜与细胞核上。组织特异性分析结果表明,GmHMADP在宁镇1号和湘豆3号2个品种的发育和成熟中的种子中表达量较高。与相应的对照组相比,在宁镇1号种子中,高温高湿胁迫48、96和168 h后,GmHMADP的表达量显著（P ＜0.01）升高;在抗性品种湘豆3号中,该基因在处理24、48、96和168 h时表达量显著（P ＜0.01）升高;湘豆3号中,GmHMADP的表达量在不同浓度Cu²⁺、Cd²⁺的诱导下均显著（P ＜0.01）升高;而宁镇1号中,GmHMADP的表达量仅在50 μmol·L^-1 Cu²⁺和200 μmol·L^-1 Cd²⁺处理下显著（P＜0.01）升高。GmHMADP过表达拟南芥株系经高温高湿胁迫后的发芽势、发芽率及种子活力均显著（P＜0.01）高于野生型植株;经Cu、Cd胁迫后,转基因拟南芥株系的根长和干重均显著（P＜0.05）高于野生型植株。【结论】GmHMADP参与高温高湿胁迫下种子活力的形成并响应Cu、Cd胁迫,在拟南芥中过表达GmHMADP可提高拟南芥的种子活力以及对Cu、Cd胁迫的耐受性。