异源四倍体鲫鲤肝组织线粒体DNA的研究

用密度梯度离心和DNaseI、RNase消化法从异源四倍体鲫鲤(R8)和鲫鲤F2肝组织中提取和纯化线粒体DNA(mtDNA).用9种限制性内切酶对异源四倍体鲫鲤和鲫鲤F2的mtDNA进行了分析,结果表明XbaI和BglⅡ两种限制性内切酶在异源四倍体鲫鲤mtDNA上存在酶切位点多态性.通过凝胶电泳测得异源四倍体鲫鲤mtDNA相对分子量平均约10.29×106道尔顿,分子大小为16.20kb;鲫鲤F2mtDNA相对分子量为10.18×106道尔顿,分子大小为16.02kb.根据单酶解和双酶解的片段数目和分子大小,构建了异源四倍体鲫鲤mtDNA的7种限制性内切酶(KpnI、PstI、SalI、XhoI、BglⅡ、BamHI和XbaI)酶切图谱.     

昆明小白鼠肾小管上皮细胞原代分离培养方法的建立

旨在通过比较胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法对小白鼠肾小管上皮细胞分离效果,以及酶消化作用时间(10、20、30min)、鼠龄(成年鼠、乳鼠)对细胞产量和质量的影响研究,经细胞鉴定,建立一种小白鼠肾小管上皮细胞分离培养的方法。选用两组昆明小鼠(成年鼠和10～14日龄幼鼠),用0.1%胶原蛋白酶、0.25%的胰蛋白酶分别消化成悬液,酶的作用时间分别为10、20、30min,用倒置显微镜观察细胞培养质量,用免疫细胞化学方法鉴定细胞种类。结果表明,成年小鼠肾脏分离效果比幼鼠好;两种酶消化10min得到的细胞产量最多;胶原酶消化法比胰蛋白酶消化法分离的细胞贴壁早,且贴壁数量多;细胞鉴定结果为阳性。结论:对成年昆明小鼠肾脏,用胶原酶消化法,消化10min,肾小管上皮细胞产量和质量较好。     

中华鳖裙边胶原蛋白的提取及其特征

胶原蛋白是生物体内一种重要的蛋白质,也是结缔组织的主要蛋白成分。与陆生动物(如猪、牛等)比较,水生动物胶原蛋白具有优良的理化性质和生理活性功能,已引起人们的广泛关注。中华鳖是我国传统的名贵水产品,其裙边胶原蛋白含量丰富,具有极高的药用价值和营养价值。采用胃蛋白酶酶解法在酸性条件下提取中华鳖裙边胶原蛋白,研究酶添加量、底物浓度、提取时间对提取效果的影响,确定了制备裙边胶原蛋白的最适条件为：酶添加量4 mg/mL,底物浓度4%,提取时间14 h。粗提胶原蛋白通过盐析、透析等纯化步骤,再经SDS-PAGE电泳、热变性温度测定、紫外及傅立叶变换红外扫描等技术方法分析了胶原蛋白的生化特征,结果显示提取到的裙边胶原蛋白具有较高的纯度,含有两条α链和1条β链,属于典型的I型胶原蛋白。研究表明：中华鳖裙边胶原蛋白可以作为猪皮、牛皮胶原蛋白的有效替代品,这为今后进一步综合开发利用鳖类裙边胶原多肽提供了科学的理论依据。     

投喂和灌喂裙带菜凝集素对鲫免疫活性物的诱导作用

以裙带菜凝集素(Undaria pinnatifida Lectin)作为免疫增强剂,来研究其对鲫免疫活性的诱导作用。用裙带菜凝集素对鲫(Camssius auratus)进行投喂和灌喂,9d后测定鲫血清的血凝活性、溶菌酶(LSZ)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性与对照组相比都有提高。其中投喂裙带菜凝集素组比投喂对照组依次提高2.0倍,3.1倍,1.2倍,1.7倍;灌喂裙带菜凝集素组比灌喂对照组依次提高4.0倍,3.2倍,1.9倍,1.6倍。这说明凝集素对免疫系统的功能,提高血凝活力、溶菌酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力都有重要作用。由此可以看出来:凝集素可以作为一种免疫增强剂激活鲫的免疫系统,对鲫的非特异性免疫功能具有明显的增强作用。     

方正银鲫、白鲫与鲫线粒体DNA限制性内切酶酶切比较

用 Bam HI、Eco RI、Dra I、Hinf I、Hind III、Hpa II、Msp I、Pst I、Sau 3AI、Sma I、Xba I、Xho I和 Sal I等十三种限制性内切酶对方正银鲫(Carassius aur-atus gibelio)、白鲫(Carassius auratus cuvieri)和鲫(Carassius auratus auratus)的线粒体 DNA(mt DNA)进行单酶酶切以及其中八种识别六碱基对序列的限制性内切酶的双酶酶切,经琼脂糖凝胶电泳后,分析且计算出各酶切片断大小,得出三种鲫鱼的 mt DNA分子大小:方正银鲫为 15990±90碱基对(bp);白鲫为 16600±130碱基对(bP);鲫为 15540±140碱基对(bp),并且分别建立了方正银鲫、白鲫和鲫 mt DNA由 Bam HI、Pst I、Eco RI 及 Xba I等四种限制性内切酶构建的酶切图谱。     

鲫卵黄脂磷蛋白的纯化鉴定及其夹心ELISA的建立

鲫(Carassius carassius)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vtg)是检测水体环境雌激素活性常用的生物标志物。本研究利用凝胶过滤结合离子交换层析与选择性沉淀结合离子交换层析2种方法,从鲫卵巢匀浆液中纯化得到了卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv),经鉴定该蛋白含有糖、磷、脂基团,天然分子量约为521 kD,SDS变性电泳显示分子量为117 kD和103 kD的2个亚基。Western blot结果显示,金鱼(Carassius auratus)Lv抗体和斑马鱼(Danio rerio)Lv抗体都能与鲫Lv发生很好的交叉反应。利用纯化的鲫Lv与金鱼Lv抗体和斑马鱼Lv抗体建立了2种夹心ELISA,发现金鱼Lv和鲫Lv的结合曲线基本重合,并且利用鲫Lv与金鱼Lv抗体建立的夹心ELISA工作范围为15.6~1000 ng/mL,检出限约为6.8 ng/mL,显著低于利用斑马鱼Lv抗体建立的夹心ELISA,结合此前研究者建立的鲫Vtg竞争ELISA,为鲫Vtg指标的测定提供了可靠方法。     

草鱼和银鲫肠道产消化酶细菌的研究

检测了分别从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和银鲫(Carassius auratus gibelio)肠道中分离的180株细菌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的产酶能力。结果显示,两种鱼肠道内可分泌胞外消化酶的细菌包括Aero-monas(气单胞菌属,Aer.)、Vibrio(弧菌属,Vib.)、Bacillus(芽孢杆菌属,Bac.)、Pseudomonas(假单胞菌属,Pse.)四个种属的细菌,Aer.在其中占主要优势,45.71%的Aer.可分泌胞外消化酶。草鱼可分泌上述四种胞外消化酶的菌株共有33株,占肠道菌总数的36.67%;银鲫43株,占47.78%。产酶菌的分布上,草鱼中肠内产消化酶细菌数量显著多于前肠和后肠(P<0.05),前、中、后肠分别是6株、20株和7株;银鲫中肠和后肠数量差异不显著,前肠分布最少。草鱼分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的菌株分别有21株(23.33%)、10株(11.11%)、30株(33.33%)和16株(17.78%)。银鲫肠道内未检测到可分泌纤维素酶的细菌,蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶菌株的数量分别是21株、37株和17株。可见鱼类肠道细菌对食饵消化有重要作用。     

大鲵皮肤中胶原蛋白的初步提取分析与应用研究

正中国大鲵(Andrias davidianus Blanchard)俗名"娃娃鱼",属于两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科,为国家二级保护动物。目前,顾赛麒等在低温4℃条件下,采用酸法(0.5摩尔/升乙酸)和酶法(胃蛋白酶)对人工养殖大鲵皮中的胶原蛋白进行了提取,对提取纯化后经过测定为Ⅰ型胶原蛋白。李华在低温4℃条件下使用酶解工艺提取养殖大鲵皮中的胶原蛋白紫外     

银鲫肠道内抑制嗜水气单胞菌的潜在益生菌筛选及其特性研究

从养殖的银鲫(Carassius auratus gibelio)肠道中分离纯化得到60株具有不同特征的菌株,以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为指示菌,点种法初筛得到12株菌株,再通过牛津杯实验筛选出4株对嗜水气单胞菌有明显抑制作用(抑菌圈直径在14 mm以上)的益生菌疑似株,并进行了耐热试验、耐酸试验和人工肠液耐受试验,筛选出最符合益生菌功能特性的菌株YJ-9。该菌株在90℃高温水浴30 min后相对存活率为1.51%,在pH3的液体培养基中4 h内相对存活率为8.37%,活菌数都保持在106 CFU/mL以上,并且可以在人工模拟肠液中缓慢生长。在急性毒力实验中,10倍于实验剂量的菌株YJ-9对银鲫无毒,动物保护实验证明菌株YJ-9能有效增强银鲫对嗜水气单胞菌的免疫抵抗力,相对保护率达到80%。研究结果表明,菌株YJ-9可以作为一个新的饲用微生态制剂候选菌种。     

淇河鲫IL-8原核表达系统的构建及多克隆抗体的制备与鉴定

为揭示淇河鲫(Carassius auratus var.Qihe)白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的功能,本研究构建了原核表达系统,并制备了兔抗鲫IL-8多克隆抗体。首先采用RT-PCR法扩增淇河鲫IL-8基因编码序列中不含信号肽的基因片段,克隆到pET-32a(+)载体后转化入Rosetta菌株构建原核表达系统。经IPTG诱导表达出相对分子质量约27.8 kD的目标融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,效价达1︰10~5。经免疫亲和层析纯化的抗体能特异性识别重组和天然的淇河鲫IL-8蛋白。比较不同组织的免疫组化和荧光定量PCR结果,IL-8蛋白量和mRNA的表达量在不同组织间变化趋势一致,在肌肉、脾和头肾均检测到较高的表达量,肠道的表达量较低。本研究为进一步探讨淇河鲫IL-8的生物学功能奠定了基础。     

饲料中添加柠檬黄对鲫肝、肠组织结构、抗氧化指标及肠道菌群的影响

为研究合成食用色素柠檬黄对水生生物的影响，本研究以初始体重为（35.0±1.5）g的鲫为研究对象，探究了不同剂量（0、1.4、5.5和10 mg/kg bwt/day）柠檬黄摄入对鲫肝、肠组织结构，抗氧化性能以及肠道菌群的影响。结果显示 ，与对照组相比，1.4 mg/kg bwt/day柠檬黄的摄入即可导致肠上皮细胞空泡化，肠绒毛变短；5.5 mg/kg bwt/day的摄入量引起肠绒毛断裂，而10 mg/kg bwt/day处理组病理现象更严重；肝脏组织学显示，1.4 mg/kg bwt/day柠檬黄摄入导致肝细胞细胞核萎缩、变形；5.5 mg/kg bwt/day的摄入量引起肝细胞核溶解，细胞空泡化增多；10 mg/kg bwt/day导致细胞界限模糊不清，细胞变形，空泡化加剧，肝血窦不可见，肝小叶结构模糊；1.4 mg/kg bwt/day柠檬黄摄入即可引起血清与肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以及谷胱甘肽（GSH-Px）活性下降，丙二醛（MDA）含量升高；肠道内容物测序结果表明，柠檬黄的摄入引起鲫肠道微生物Chao1、Shannon和Simpson等多样性指数变化，一些有益菌（芽孢杆菌和梭状芽胞杆菌）数量明显减少，而一些致病微生物（如蛭弧菌和希瓦氏菌）的数量明显增加。 以上结果表明，柠檬黄的摄入会导致鲫肝、肠组织结构造成损伤，并对其血清抗氧化指标及肠道菌群造成不同程度的影响。本研究结果有助于进一步了解柠檬黄在水生生物体内的毒性机制，为水生态环境污染及水质检测提供科学依据。     

胶原蛋白部分替代鱼粉饲养异育银鲫的试验

进行了两个试验以评价水产饲料中胶原蛋白替代鱼粉的效果。生长试验是在基础饲料(对照组,含鱼粉12%)中分别以2%、4%胶原蛋白等重量替代鱼粉饲养平均体重6.5g的异育银鲫(共315尾)35d,各组鱼体增重率分别为71.3%,70.9%,71.9%,各组间没有显著差异(P>0.05);消化试验是采用平均体重110g的异育银鲫,按套算法测定了异育银鲫对胶原蛋白的蛋白质消化率为97.3%。研究结果表明,胶原蛋白具有很高的消化吸收率,可部分替代鱼粉而对异育银鲫的增重无影响。     

鲤鲫杂交回交鲫染色体核型及DNA含量的分析

将性成熟的鲤鲫杂交鱼一代（F1）的雌鱼与雄性红鲫鱼杂交,获得了回交鲫子代,分析了平均体质量94.2g的1龄回交鲫子一代的细胞染色体核型,测定了其DNA含量。肾细胞直接制片法表明：回交鲫子代染色体由147条组成,即3n=147,NF=222,其核型公式为：3n=51m＋24sm＋27st＋45t。流式细胞记数法结果表明：在20尾鱼中有14尾回交鲫子代细胞的DNA含量是对照鱼（红鲫鱼）的1.5倍,占总鱼数的70%;6尾在2～3倍体之间,非常接近三倍体,占总鱼数的30%。本结果与其细胞染色体核型分析结果基本一致,说明该鱼是以三倍体为主的回交种。     

休眠方式、温度和时间对离水储藏鲫鱼生理指标的影响

为研究休眠方式、温度和时间对鲫鱼活体离水后储藏的影响,将鲜活鲫鱼分别由室温(14 ℃)以1 ℃/h速率降温至0 ℃诱导休眠以及40 mg/L丁香酚浸浴2 min麻醉,在0、4、8 ℃条件下离水储藏,以血液指标、酶活力等反映鱼体在不同储藏时间下的生理状态及损伤程度。试验结果显示,丁香酚麻醉后鲫鱼血清皮质醇水平无明显变化。随离水储藏时间的延长,肝糖原逐渐消耗,琥珀酸脱氢酶活力升高,同时较高的储藏温度导致脑丙二醛含量升高,血清中乳酸含量及过氧化氢酶活力升高。试验结果表明,不同麻醉方式对离水储藏鲫鱼的存活能力无明显影响,影响鲫鱼存活能力的因素为储藏温度,其升高1 ℃,鲫鱼复苏时间延长一个等级的几率增大1.42倍。     

乳化剂对异育银鲫消化酶及血清指标的影响

选取8000尾异育银鲫,随机分为2个处理(对照组和试验组),每处理2重复,每重复2000尾,分别饲喂含乳化剂0%和0.05%的基础日粮,试验期为62 d。试验结果表明,饲养31 d后,添加乳化剂使异育银鲫的肝胰脏胰蛋白酶的活性显著提高(P<0.01),肠道胰蛋白酶活性也表现出升高的趋势(P=0.08);血清中总蛋白、球蛋白、葡萄糖和甘油三酯的含量也显著提高(P<0.01)。饲养62 d后,添加乳化剂使异育银鲫肠道淀粉酶活性显著高于对照组(P<0.05);血清中葡萄糖和甘油三酯的含量显著高于对照组(P<0.01)。试验结果表明,饲料中添加乳化剂能够提高异育银鲫的肠道和肝胰脏消化酶的活性,促进脂肪代谢和蛋白质沉积。     

牛磺酸、γ-氨基丁酸对鲫抗缺氧能力的影响

研究牛磺酸、γ-氨基丁酸对鲫抗缺氧能力的影响,结果表明质量分数5‰、7‰牛磺酸水溶液对鲫抗缺氧能力有显著(P<0.05)和极显著作用(P<0.01),质量分数3‰γ-氨基丁酸水溶液对鲫抗缺氧有显著作用(P<0.05)。实验证明,γ-氨基丁酸、牛磺酸均可提高鲫的抗缺氧能力。     

鲫的挥发性成分

新鲜鲫具有以草腥味、泥土味等混合的气味,其强度以内脏最强,皮次之,肌肉最弱。采用GC－嗅觉感官试验和GC－MS鉴定分析结果表明：同鲫特征气味最为相关的成分为己醛;其他相关物质有1－戊烯－3－酮、2,3－戊二酮、1－戊烯－3－醇、反－2,顺－4－庚二烯醛、1－门牌烯－3－醇、1,5－辛二烯－3－醇等C5－C8的羰基化合物和醇类。鲫的鱼皮和鳃的粗酶液中存在着类脂肪氧化酶活性,由底物花生四烯酸生成3种C8挥发性成分。