猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特异性引物和用3种荧光基团标记的核酸探针,通过条件优化建立了针对这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能够特异性检测PEDV、TGEV和PRo VA,而与其它病原无交叉反应;对TGEV、PEDV和PRo VA的最低检测量分别为1.12拷贝/μL、39拷贝/μL和25拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于5%;该方法与商品化的试剂盒检测结果符合率达100%。该方法快速、敏感,检测结果准确可靠,为猪病毒性腹泻疾病的流行病学调查和分子生物学快速诊断奠定了基础。     

布鲁菌缺失疫苗株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA的构建及毒力和免疫原性的评估

【目的】利用分子生物学技术,通过同源重组的方法构建了新型的羊种布鲁菌Brucella melitensis减毒活疫苗株,为布鲁菌的防治提供新的选择.【方法】以羊种布鲁菌减毒活疫苗M5株及缺失bp26基因的M5-Δbp26缺失突变株为亲本株,利用电击转化法,将含有znuA基因上下游同源臂的自杀质粒转入到亲本株中,通过同源重组敲除znuA基因.对构建的新型基因缺失株进行生物学特性及毒力的鉴定与分析.【结果和结论】PCR及核苷酸序列测序结果表明,羊种布鲁菌减毒活疫苗znuA单基因缺失株和bp26、znuA双基因缺失株均构建成功,分别将其命名为M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA.与亲本株相比,2种缺失突变株的生物学特性没有显著性差异;体外连续传至20代后,菌落PCR和核苷酸测序结果显示M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA株具有良好的遗传稳定性.小鼠脾脏质量和脾脏菌落数表明,M5-Δbp26-ΔznuA双基因缺失株毒力最弱,单基因缺失株M5-ΔznuA和M5-Δbp26次之.血清中抗体水平的监测显示,znuA基因的缺失对布鲁菌减毒活疫苗诱导机体体液免疫的能力没有影响.获得了免疫原性保持良好而毒力减弱的羊种布鲁菌减毒活疫苗基因突变株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA.     

禽大肠杆菌耐药标记弱毒菌株O_2(Nor~r,Chl~s)和O_(78)(Chl~r,Nor~s)的培育

选择最常见的禽致病性大肠杆菌Ｏ２和Ｏ７８菌株，分别以常用的抗菌药物氟哌酸和氯霉素诱导，培育成遗传性稳定的耐药标记弱毒菌株Ｏ２（Ｎｏｒｒ，Ｃｈｌｓ）和Ｏ７８（Ｃｈｌｒ，Ｎｏｒｓ），为进一步运用原生质体融合技术培育Ｏ２和Ｏ７８融合双价耐药弱毒菌株打下了基础     

猪瘟病毒感染西藏小型猪致免疫器官损伤的组织病理学研究

为了研究CSFV感染对西藏小型猪的致病性及组织病理学方面的影响,将6头4月龄健康西藏小型猪随机分成2组,其中感染组4头,对照组2头。感染猪颈部肌肉注射CSFV石门株血毒(1×10~5TCID_(50)/头),对照组猪注射等体积生理盐水。CSFV接种后每天监测动物体温并观察临床症状,于CSFV感染后第9天剖杀全部试验动物,测定血液CSFV核酸载量,观察各组织器官病理变化并采集扁桃体、颌下淋巴结、脾脏、胸腺等免疫器官进行组织病理学研究。结果显示,CSFV感染后第2天猪只体温超过40.2℃,开始出现精神沉郁、食欲减退、便秘等临床症状;CSFV感染后濒临死亡时猪血液中病毒含量最高达1×10~(8.9)Copies/mL,最低含量为1×10~(5.2)Copies/mL。组织病理学结果显示,CSFV感染猪扁桃体间质、颌下淋巴结被膜和脾脏的淋巴滤泡周围可见大量出血及片状坏死,颌下淋巴结生发中心可见局部增生性变化,胸腺间质可见炎性细胞浸润。对照组猪血液CSFV核酸为阴性、病理和组织学切片未见异常。结果表明,本研究成功建立CSFV感染西藏小型猪的动物模型,CSFV感染西藏小型猪后对扁桃体、脾脏、淋巴结和胸腺等免疫器官造成损伤,使机体免疫功能降低。     

兽医微生物学学科发展

兽医微生物学主要研究病原微生物的特征及其与动物疾病之间的关系,并应用微生物学、分子生物学和免疫学知识与技术来诊断和防治动物疫病以及人兽共患病,在保障畜牧生产发展、动物源性食品安全和人类健康方面起着重要作用.近20年来,伴随着分子和细胞生物学理论和技术的飞速发展,兽医微生物学在基础研究、技术创新和应用方面也取得了重要进展.     

蓝舌病16型病毒核心样颗粒的获取与鉴定

为了制备一种新型基因工程疫苗BTV-16 VLP疫苗,将蓝舌病病毒16型VP3与VP7基因片段插入杆状病毒双表达载体pFastBac Dual质粒中,通过转染Sf9细胞,同时表达VP3与VP7蛋白。经负染后电镜观察到有与蓝舌病病毒形态相似的核心样颗粒,表明蓝舌病VP3与VP7蛋白能自主组装形成核心样颗粒,并通过Western Blot试验验证该核心样颗粒与蓝舌病病毒具有相同的抗原性。因此本研究成功构建出16型蓝舌病病毒核心样颗粒,为病毒样颗粒装配打下了基础,为制备16血清型BTV VLP疫苗做好前期准备。     

乙型脑炎病毒EⅢ基因片段的表达与EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

为了研制乙型脑炎病毒EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒,将乙型脑炎病毒EⅢ基因克隆至原核表达载体p ET-32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。以纯化后的重组蛋白EⅢ包被酶标板,优化ELISA反应条件,组装试剂盒。SDS-PAGE和Western bloting分析表明,重组蛋白分子质量约为30ku,经IPTG诱导后高效表达,且具有来良好的免疫原性。优化试验确定重组抗原最佳包被浓度为4.7μg/m L,血清样本的阳性临界值为0.255。特异性试验结果表明,重组蛋白与猪瘟、猪伪狂犬、猪圆环病等多种病原体的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果表明,血清稀释至1∶6400时仍检测为阳性。该试剂盒的批内、批间变异系数均小于10%。用该试剂盒检测224份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为90.7%。研究结果表明,原核表达的猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ蛋白具有良好的免疫原性,研制的猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒敏感性、特异性和重复性较好,为猪流行性乙型脑炎的抗体水平检测、流行病学调查、类症鉴别等方面提供了重要方法。     

鸡白介素18基因原核表达质粒构建

根据已发表的江西土鸡白介素 -1 8(Ch IL-1 8) c DNA编码基因序列设计引物 ,用PCR技术从 p MDCh IL-1 8质粒扩增出编码鸡IL-1 8成熟蛋白基因 ,重组于 p BV2 2 0表达载体上 ,将重组质粒转化大肠杆菌 JM1 0 9(DE3 ) ,转化子经温度诱导的表达产物 ,SDS-PAGE电泳鉴定约 2万 ,N端开头 1 5个氨基酸序列测定分析 ,证明获得了鸡 IL-1 8成熟蛋白 ,为今后深入研究鸡 IL -1 8的生物学特性及其临床应用打下了基础     

现代禽病防治技术专题（七）：鸡非典型性新城疫的病因诊断和防制

随着养鸡业的发展,原来呈毁灭性流行、发病率及死亡率高、临床症状和病理变化典型的鸡新城疫已不多见。鸡新城疫的流行趋向慢性化和非典型化,这给该病的诊断和防制提出了新问题,也给养鸡生产造成较大的经济损失。１发病原因１．１鸡场受病毒的严重污染,病毒毒力增强我...     

噬菌体展示技术筛选副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的抗原表位

为了研究副猪嗜血杆菌（HPS）外膜蛋白P5的抗原表位,应用噬菌体展示随机12肽库,以抗HPS外膜蛋白P5的单克隆抗体作为固相分子,进行了3轮筛选。对随机挑选出的10个分离间隔良好的噬菌斑进行ELISA和West—ernblot等检验,最终确定了4个各结果均为阳性的优势短肽。将4个短肽序列与GenBank中HPS外膜蛋白p5的序列进行比对分析,发现这些序列没有同源性或同源性较低,但竞争ELISA结果显示这些短肽与单抗的结合都能够被外膜蛋白P5有效的抑制。以上结果显示,通过噬菌体展示技术成功获得了4个HPS外膜蛋白P5的模拟表位,为后期开展以抗原表位为基础的诊断、表位疫苗等研究提供了依据。