一种不依赖于无菌培养的拟南芥活体转基因种子筛选方法

    拟南芥活体转基因种子的筛选仍主要采用无菌培养技术,存在操作麻烦,容易污染而造成转基因材料损失等问题.本研究在传统组织培养筛选技术的基础上,通过去除原培养基成分中对种子发芽和筛选不必需的蔗糖和有机成分,降低大量元素的浓度,缩短筛选时间,从而免除了传统转基因种子筛选中培养基和种子消毒的繁琐步骤,建立了一种不依赖于无菌培养的转基因种子筛选方法.与无菌培养筛选比较,筛选效果相同,但简化了试验步骤,提高了筛选操作的可靠性.     

潮霉素对紫花苜蓿愈伤组织诱导和分化的影响

潮霉素是当今基因工程中的一种转化选择剂。通过对苜蓿叶片诱导阶段、分化阶段施加不同浓度的潮霉素,确定潮霉素对紫花苜蓿叶片愈伤组织形成及其分化的影响。研究表明,潮霉素对紫花苜蓿叶片愈伤组织诱导与分化有显著的抑制作用。当潮霉素浓度达到15mg/L时苜蓿叶片完全无法诱导愈伤;愈伤和分化阶段都添加10mg/L潮霉素时,虽然可以诱导出愈伤组织但无法分化。因此建议在遗传转化时诱导愈伤阶段及分化阶段都添加10mg/L潮霉素。     

转基因及常规水稻幼苗对潮霉素敏感性的研究

研究了转基因及常规水稻幼苗叶面喷施潮霉素B溶液后的反应。结果发现,常规水稻吸收潮霉素B后,叶片会出现以褐斑为特征的中毒症状。在50～100mgL浓度范围内,褐斑的数目和面积随时间和浓度的增加而增加,溶液中滴加DMSO可提高潮霉素对稻苗的毒性。浓度在75mgL及以上时,喷后第7天,处理的所有幼苗都出现症状。而浓度在50mgL时,个别幼苗经处理后未出现中毒症状。在上述浓度范围内,带潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的Bt转基因水稻(克螟稻)幼苗均未出现中毒症状。苗期鉴定与抽穗前后成株期鉴定的结果相一致。讨论了叶面喷施潮霉素B溶液在转基因水稻育种和筛选潮霉素敏感转基因水稻突变体中的可能应用。     

拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织对潮霉素的反应

研究了潮霉索对拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织的作用效果和特性．结果表明：潮霉素对拟南芥悬浮细胞生长、愈伤组织诱导及其生长均有极明显的抑制作用。但作用效果和特性均有所不同；拟南芥悬浮细胞继代培养阶段、愈伤组织诱导阶段和愈伤组织增殖阶段的临界致死质量浓度分别为25、2．5、1．5mg／L，液体与固体培养条件下差异极大；潮毒素需要一定处理时间才能充分表现其抑制细胞生长或杀死细胞的效果，一般液体培养条件下3d以后、固体培养条件下5d以后效果趋于稳定，但不同的处理质量浓度有较大差异．还就液体与固体培养条件下作用效果差异的原因进行了讨论，并提出了对潮毒素抗性标记筛选的建议．     

小麦遗传率中潮霉素适宜筛选浓度的研究

研究了潮霉素不同质量浓度对西农 1376和京花 1号小麦愈伤组织及种子的筛选效果。结果表明 ,潮霉素对小麦愈伤组织的适宜筛选质量浓度为 110 mg/L,对转基因小麦后代种子筛选以 14 0 mg/L 较为适宜 ;不同基因型材料对潮霉素的敏感性存在一定差异     

Effect of temperature on growth,dry matter production and starch accumulation in ten mango (Mangifera indica L.) cultivars

Summary

Ten mango cultivars of tropical and subtropical origin (Carabao, Kensington, Nam Dok Mai, Alphonso, Dashehari, Florigon, Glenn, Irwin, Haden and Sensation) were grafted onto cv. Kensington seedling rootstock and held at four day/night temperatures for 20 weeks (15/10°C, 20/15°C, 25/20°C and 30/25°C). Vegetative growth increased with increasing temperatures. All grew vegetatively at 25/20°C and 30/25°C. Cultivars which did not grow at 20/15°C were Carabao, Kensington and Dashehari. Cultivars Kensington, Nam Dok Mai, Alphonso, Florigon, Glenn, Irwin, Haden and Sensation produced flower panicles at 15/10°C. The rise in temperature increased the average number of growth flushes (in responsive cultivars) from 0.48 at 15/10°C to 3.21 at 30/25°C, and the number of leaves per growth flush (1.22 at 15/10°C to 13.63 at 30/25°C). Distribution of dry matter from new growth was mostly to the roots at the lowest temperature (95% at 15/10°C) and to the leaves (58%) at 30/25°C. The mean daily temperature for zero vegetative growth was calculated to be 15°C. Temperature and related growth activity also affected the concentration of starch in the woody tissue of rootstock trunks at the end of 20 weeks (15.9% starch at 15/10°C v. 4.8% starch at 30/25°C). ‘Irwin’ had the highest starch concentration at the two higher temperatures (twice that of any other cultivar at 30/25°C) while ‘Kensington’ the lowest starch level at 25/20°C, ca. 50% of most other cultivars.     

以对潮霉素抗性为筛选标记的棉花遗传转化

以 HPT基因作为筛选标记基因 ,潮霉素作为筛选剂 ,通过农杆菌介导法将 GFP基因导入棉花细胞并得到再生植株。经过 Southern杂交证实外源基因已经整合到棉花基因中 ,荧光显微镜可以观察到绿色荧光 ,说明 GFP基因得到表达。研究确定了潮霉素作为棉花转化的筛选剂在农杆菌介导的转化中适用的浓度范围及筛选方法 ,即棉花转化中潮霉素的筛选浓度范围为 2 .5～ 1 0 mg· L- 1,在有 GFP等一些易于观察和检测的标记基因存在时 ,起始浓度可用较低 ( 2 .5 mg· L- 1)的筛选浓度 ;而在没有标记基因或检测方法较复杂时 ,起始浓度用较高 ( 1 0 mg· L- 1)的筛选浓度     

籼稻不同品种的遗传转化和植株再生

用携带水稻蜡质基因反义 RNA片段的 p1 3 W4质粒的根癌农杆菌 EHA1 0 5 ,分别感染籼稻品种龙特甫 B、协青早B、珍汕 97B和 -3 2 B的幼胚愈伤组织 ,经共培养和在潮霉素 2 5～ 5 0 mg/L浓度下的二次筛选后 ,获得了对潮霉素表现抗性的愈伤组织 ,抗性愈伤组织的频率在 2 0 .1 %～ 2 7.1 %之间 ;抗性愈伤组织经分化培养 ,分化频率在 1 2 .0 %～ 2 1 .2 %。品种间绿菌分化情况存在较大差异 ,龙特甫 B的抗性愈伤组织分化成绿苗的频率为 8.8% ;珍汕 97B的抗性愈伤组织虽能分化 ,但是 ,无法获得绿苗。对转基因植株分别进行了 GUS活性测定和 PCR检测 ,结果显示 :获得的转基因植株 ,92 %的植株GUS检测呈阳性反应 ,并能正常结实 ,在 T1种子的胚乳中也能检测到 GUS染色的分离 ,证明外源基因确已导入这些植株中 ,而且 ,能正常遗传。在抗性愈伤组织的分化中 ,试验了潮霉素对分化的影响 ,结果显示 :不添加潮霉素 ,能明显地提高绿苗频率 ,但转基因植株的可靠性也随之下降。     

黄瓜遗传转化体系优化及表皮毛基因Gl的转化

选用黄瓜无毛突变体gl的子叶节为材料,对芽诱导阶段及根诱导阶段潮霉素的浓度进行筛选,分别确定2和3mg/L为其最适浓度;以pCAMBIA2301-gusA为载体,农杆菌GV3101介导,筛选出Silwet L-77(表面活性剂)的最佳体积分数为0.04%,侵染液浓度以原菌液(OD600=0.6)等倍稀释最佳;另外,对快速提取黄瓜DNA方法进行了优化。结果表明,添加500μL 0.5mol/L NaOH与200μL 100mmol/L Tris-HCl的组合最好。用优化的体系对表皮毛基因Gl进行遗传转化,获得7株阳性苗,为研究Gl基因的调控机制奠定了基础。     

以潮霉素抗性为选择标记的毛壳霉原生质体转化

利用PEG方法，将含有潮霉素抗性标记的质粒pCB1003转化毛壳霉原生质体,并在高于毛壳霉敏感的潮霉素浓度下筛选转化子。转化率达1～2个转化子/μg质粒DNA。以潮霉素抗性的毛壳霉转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增及其产物的Southern杂交。结果表明，潮霉素抗性基因已整合入毛壳霉染色体。稳定性试验表明，所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。