鸭瘟病毒强毒株在急性人工感染成年鸭病例体内分布规律

5 6只 3月龄四川麻鸭经皮下接种鸭瘟病毒 (DPV)强毒 SC1株 ,成功建立了 DPV感染的急性病理模型 ,并应用PCR方法检测了不同时间 DPV在感染鸭体各组织器官的分布情况。结果表明 ,接种 2 h后 ,即能够从脑、肝、脾、法氏囊、胸腺中检出 DPV DNA;12 h,可从心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、脑、胸肌、食管、腺胃、血液、舌、口腔分泌物、皮肤、骨髓和粪便等检测到 DPV的 DNA。检出时间最早和检出率最高的组织器官为肝脏和脑组织。本试验为阐明 DPV的致病机理和应用 PCR方法检测感染鸭体组织中的 DPV提供了重要的实验数据。     

淋巴细胞转化试验在鸭体上的应用——Ⅱ.鸭瘟病毒对鸭外周血淋巴细胞转化能力的影响

试验鸭32只分4组,第1组接种鸭瘟强毒,第2组接种鸭瘟弱毒,第3组先接种鸭瘟弱毒,2周后再接种鸭瘟强毒,第4组为对照。采用外周血淋巴细胞转化试验,检测鸭瘟病毒对鸭外周血淋巴细胞转化能力的影响,结果鸭瘟强毒和鸭瘟弱毒对鸭淋巴细胞的PHA反应性均有抑制作用。其中鸭瘟强毒的作用迅速而且强烈,在很短的时间内即造成宿主淋巴细胞对PHA的反应剧烈下降,并很快导致动物死亡,出现典型的鸭瘟病变,但也有个别鸭能够耐过强毒的攻击而生存下来,耐过鸭淋巴细胞对PHA的反应性逐渐恢复正常,剖检未见有鸭瘟病变;鸭瘟弱毒的抑制作用是暂时的,宿主淋巴细胞对PHA的反应性很快即恢复正常,剖检也未见有鸭瘟病变;对于接种鸭瘟弱毒以后再攻强毒的鸭,其对PHA刺激的反应性未受到影响,攻毒后2周,宿主还表现出对PHA的反应能力有增强的趋势,剖检未见有鸭瘟病变。此结果与其他病毒所致的PHA反应抑制和加强作用相类似。     

鸭瘟病毒河南株gI基因的克隆与测序

参考GenBank中鸭瘟病毒gI基因序列设计并合成引物,以鸭瘟病毒河南分离株DNA为模板进行PCR扩增,将扩增片段克隆至PGEM-T载体上,得到含gI基因重组质粒。经酶切鉴定,并对重组阳性质粒进行序列测定。结果表明,获得的片段含鸭瘟病毒gI基因,全长1 089 bp,与已报道的其他疱疹病毒gI基因具有较高的同源性,编码432个氨基酸,蛋白分子质量为39.7ku、等电点(PI)为6.06。     

Effect of cell mediated immunity regulation of duck enhanced by duck IFN-α eukaryon expression plasmid and inoculated with DPV attenuated vaccine by gene-gun

In order to study the effect of cell mediated immunity regulation of duck IFN-α eukaryon expression plasmid (pcDNA-SDIFN-α) on duck plague virus (DPV) attenuated vaccine in ducks, pcDNA-SDIFN-α was administered to 28-day-old ducks at doses of 1, 3 and 6 μg per duck, respectively, by gene-gun. PBS and empty vector pcDNA were used as control. Fifteen days later, all ducks were injected with DPV attenuated vaccine and blood samples were collected at 3, 7, 14, 21, 28, 35, 49, 63 and 84 days after injection. T-lymphocyte proliferation tests (MTT) were used to detect the T-lymphocyte proliferation in the peripheral blood (PBL) of ducks. Blood samples collected at 7, 14, 21, 28, 35 and 49 days after injection were detected by fluorescence-activated cell sorter (FACS) for recording the number of CD₃ ⁺ T-lymphocytes of ducks. Results were as follows: (1) Reaction of T-lymphocytes in PBL to ConA (OD value) of ducks treated with pcDNA-SDIFN-α was higher than that of PBS and pcDNA control groups in 3–84 days. There were highly significant differences between the 1 μg per duck group and the two control groups in 3–84 days (P ⩽ (0.01), between the 3 μg per duck group and the two control groups in 3–84 days (P ⩽ 0.01, P ⩽ 0.05), and between the 6 μg per duck group and the two control groups in 7–49 days (P ⩽ 0.01, P ⩽ 0.05). The significant difference was also present between the groups of 1, 3 and 6 μg per duck in 3–35 days (P ⩽ 0.05). However, there was no significant difference between the 3 and 6 μg per duck groups (P ⩾ 0.05). The pcDNA control group was higher than PBS control group, but no difference was detected (P ⩾ 0.05). (2) Change of the number of CD₃ ⁺ T-lymphocytes in ducks administered with different doses of pcDNA-SDIFN-α was higher than that of PBS and pcDNA control groups in 7–49 days. The change in the 1 μg per duck group was significantly higher than that in PBS and pcDNA control groups in 14–49 days (P ⩽ 0.01). There were significant differences between the 3 μg per duck group and the two control groups in 21–49 days (P ⩽ 0.01, P ⩽ 0.05) and between the 6 μg per duck group and the two control groups in 7–49 days (P ⩽ 0.01, P ⩽ 0.05). However, no significant differences among the groups of 1, 3, and 6 μg per duck groups (P ⩾ 0.05) and between the two control groups (P ⩾ 0.05) were found. The results indicated that pcDNA-SDIFN-α administered 15 days before injection of DPV-attenuated vaccine could significantly enhance cellular immunity induced by DPV-attenuated vaccine. pcDNA-SDIFN-α is an excellent DPV-attenuated vaccine molecular adjuvant and the best result can be obtained with the dose of 1 μg per duck of pcDNA-SDIFN-α inoculated by gene-gun. __________ Translated from Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2007, 38 (10): 1066–1071 [译自: 畜牧兽医学报]     

鹅源鸭瘟与小鹅瘟二联弱毒疫苗的研究（初报）

鹅的鸭瘟和小鹅瘟是当前严重威胁养禽业的两种传染病,虽然已分别有了预防疫苗,但鸭瘟疫苗对鹅的鸭瘟效价较低,免疫期短,效果不一,特别是接种两种疫苗时,需多次注射,使用不便。根据鹅源鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒可同时在同一鸭胚复制增殖,未发现干扰作用的存在,特进行二联疫苗的研制,以便提高疫苗质量和满足防疫需要。 研究结果显示,二联苗对成鹅具有良好的安全性和免疫原性,免疫鹅对鸭瘟强毒攻击的半数有效免疫剂量(10~(6.5)ED_(50)/1ml)、免疫鹅血清对小鹅瘟病毒的中和指数(NI=7586)分别略高于鸭瘟疫苗(10~(6.5)ED_(50)/1ml)和小鹅瘟疫苗(NI=3163),免疫鹅的鸭瘟中和抗体反应和小鹅瘟沉淀抗体反应与相应的鸭瘟疫苗和小鹅瘟疫苗基本相同,从而初步研制成功二联弱毒疫苗。二联苗免疫鹅对鸭瘟有免疫力,其后代可免遭小鹅瘟侵袭,具有双重作用,由于使用同一鸭胚生产二联苗,可简化制苗工艺,降低成本,便于现场应用,减少对鹅的应激作用。     

复方中药“禽康散”对鸭瘟病毒感染鸭胚及成纤维细胞的保护效应

将不同浓度复方中药“禽康散”和鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)分别以不同方式接种到鸭胚尿囊膜后观察其对DPV感染的鸭胚保护率;用MTT法测定“禽康散”对鸭胚成纤维细胞(DEF)的安全质量浓度和增殖的影响,及安全质量浓度范围内的“禽康散”对DPV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)能力的影响.结果显示,“禽康散”在10日龄鸭胚内对DPV具有显著的杀灭和阻断感染的作用.“禽康散”对DEF的最大安全质量浓度为2-4 g/mL,在2-4～2-8 g/mL质量浓度范围内对DEF有显著的增殖和抑制DPV感染DEF的能力,且与加药方式和药物质量浓度有一定关系.结果表明,一定质量浓度的“禽康散”对DEF具有增殖作用,并对DPV在鸭胚内和细胞水平上均有较好的杀灭和拮抗作用.     

探针实时荧光定量PCR检测白藜芦醇体外抗鸭瘟病毒活性方法的建立及应用

建立以TaqMan荧光探针为特点的PCR,检测白藜芦醇体外抗鸭瘟病毒活性。本研究针对鸭瘟病毒UL30基因序列设计特异性引物和TaqMan荧光探针,建立鸭瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证方法的特异度、敏感度和稳定性及对临床样品进行检测;运用该方法检测白藜芦醇对鸭胚成纤维细胞接种鸭瘟病毒后细胞中病毒增殖情况的影响,用以评价该药物体外抗鸭瘟病毒效果。结果显示,该方法建立的定量标准曲线阈值循环数（Threshold cycle,Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系（R2=0.997）,斜率为-3.328,扩增效率（E）为99.7%,具有良好的特异度、敏感度和稳定性并能对临床样本进行准确的检测。运用该方法检测白藜芦醇体外抗鸭瘟病毒结果显示：经白藜芦醇处理后,染毒细胞中病毒拷贝数为（7.71±0.37）×10^4,与病毒对照组比较（5.63±0.26）×10^6明显减少（P〈0.01）。结果表明,TaqMan探针实时荧光定量PCR方法建立并成功用于体外药物抗鸭瘟病毒的检测;白藜芦醇具有良好的体外抗鸭瘟病毒活性。     

"双黄"在鸭胚中抗鸭瘟病毒的效力试验

用双黄杀毒退烧颗粒剂(简称“双黄”)对8组鸭胚予以不同剂量的抗鸭瘟病毒效力试验,结果表明其在鸭胚中能抑制鸭瘟病毒增殖。     

鸭瘟病毒感染鸭十二指肠黏膜炎症相关基因及调控通路的筛选

试验旨在分析鸭瘟病毒（duck plague virus，DPV）感染樱桃谷鸭后十二指肠黏膜转录组水平的变化，筛选出DPV感染后参与炎症的相关基因和调控通路。DEV-GZ株经腿部肌肉接种35日龄鸭后，于接种后24、48和72 h采集鸭十二指肠黏膜组织样本，提取总RNA进行转录组测序，对数据进行质控与注释，筛选与炎症相关的差异表达基因及调控通路，并应用实时荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果显示，对照组与试验组总计得到21.39 Gb的Clean Bases，测序样本有效序列占原始序列的99%以上，映射率高于83%。鸭接毒DPV后24 h十二指肠黏膜的差异表达基因有221个，参与炎症相关生物学过程的有3个，均为下调基因；接毒DPV后48 h差异表达基因有499个，参与炎症相关生物学过程的有17个，均为下调基因；接毒DPV后72 h差异表达基因有798个，参与炎症相关生物学过程的有20个，其中上调基因13个、下调基因7个。GO数据库分析显示，参与炎症相关的差异表达基因主要是CCR8、CCL19、CCL4、IL-17、IRF1、IFN-γ、SLC11A1等，涉及急性炎症反应、趋化因子受体活性、急性期反应、炎症反应和炎症反应的正调节等生物学过程。KEGG数据库分析显示，差异表达炎症相关基因主要富集在Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路和炎症性肠病等；实时荧光定量PCR结果显示，IFN-γ和MALT基因的相对表达倍数与转录组结果基本一致。本试验完成了DPV感染樱桃谷鸭十二指肠的转录组测序分析，获取了差异表达基因的功能注释信息，初步揭示了参与DPV感染的炎症相关通路，为深入探究DPV的致病机制提供了理论参考。     

16SrDNA实时荧光定量PCR检测DPV强毒感染鸭气管及消化道大肠杆菌动力学

参照Genebank大肠埃希氏菌属(E.coli)16SrDNA保守基因序列设计并合成定量PCR引物及针对大肠杆菌属的Taqman探针,以E.coli标准菌株的PCR扩增产物作为阳性模板制作标准曲线,建立检测E.coli的定量PCR方法。该法Mg2+最佳工作浓度5 mmol/L,能够定量和特异检测E.coli而对肠道优势菌群的代表种葡萄球菌、双歧杆菌呈阴性。检测E.coli的灵敏度可达3个/mL。利用该法对DPV强毒感染鸭急性病例的气管和消化道E.coli检测,结果表明:气管E.coli数量普遍低于对照。食道波动巨大,普遍高于对照;十二指肠、空肠变化不明显;回肠波动巨大,总体高于对照;盲肠显著低于对照;直肠与对照差异不显著。DPV感染致死鸭的气管E.coli数量显著低于对照;食道和十二指肠极显著高于对照;空肠、回肠和盲肠均略高于对照;直肠略低于对照。