肉毒毒素重组抗原表达系统研究进展

肉毒中毒是肉毒杆菌引起的一种致死性的神经麻痹性疾病,应对内毒中毒的最有效方法是预防或疫苗接种,肉毒毒素Hc段是研制亚单位疫苗的首选.通过基因重组技术能够将肉毒毒素Hc片段在大肠杆菌或酵母表达系统中进行大规模表达.阐述了这2种表达载体在肉毒毒素亚单位疫苗的研制及发酵生产情况.     

东北虎γ-干扰素基因的克隆、生物信息学分析及其在毕赤酵母中的表达

本试验旨在通过克隆东北虎γ-干扰素(IFN-γ)基因,研究其分子特征并预测蛋白生物学功能,为后续研究干扰素抗病毒活性做前期准备。通过RT-PCR从ConA诱导过的东北虎血淋巴细胞中扩增东北虎IFN-γ基因并测序,应用生物信息学方法进行序列分析。结果表明:东北虎IFN-γ编码区由504个核苷酸组成,共编码167个氨基酸,蛋白相对分子质量为19.59 ku,等电点为9.03,所编码的蛋白为碱性亲水性蛋白,其中前23个氨基酸可能为信号肽,IFN-γ编码蛋白保守结构域为IFN-γ超家族,且存在跨膜结构,其中1-6位氨基酸为胞内区域,7-28位氨基酸为跨膜区域,29-167位氨基酸为胞外区域;IFN-γ编码蛋白二级结构主要以α-螺旋(58.08%)和无规则卷曲(33.53%)为主,存在5个潜在的B细胞抗原表位,3个潜在的N-糖基化位点;分子进化分析显示,东北虎IFN-γ与GenBank上发表的东北虎、非洲狮、金钱豹、美洲狮、猎豹、家猫、加拿大猞猁、野猪等的核苷酸相似性为80.4%~99.8%,氨基酸相似性为70.5%~100%,东北虎IFN-γ与非洲狮、金钱豹亲缘关系最近,美洲狮、猎豹、家猫、猞猁次之,野猪最远。通过合成改造后的东北虎IFN-γ基因,构建能表达IFN-γ蛋白的重组质粒pPIC9K-IFN-γ,将其导入高效表达系统-毕赤酵母中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达蛋白的分子量约17.8 ku,与预期大小相符,表明东北虎IFN-γ成功表达。     

ECM 830电穿孔仪在毕赤酵母电转化中的应用

用线性化质粒与酵母细胞混合后进行电转化,培养细胞,菌体计数,通过计算转化率探索ECM 830电转仪的转化条件,确定出毕赤酵母电转化最佳条件,低电压模式;电压300 V;脉冲长度15 ms;脉冲次数为1次;为ECM 830电转仪在酵母转化中的应用提供依据.     

禽传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank已公布的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,设计1对IBV S1基因表达片段的PCR引物,用RT-PCR方法扩增出长度为1 566 bp IBV S1基因表达片段,5′端不含信号肽序列,3′端添加了终止密码子。用限制性内切酶SnaB和Not将S1基因和载体pPIC9K酶切回收后连接,构建了重组表达载体pPIC9K-S1。用限制性内切酶Bgl将表达质粒pPIC9K-S1线性化,然后用电转化的方法导入毕赤酵母GS115,在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定和表型筛选后,获得了整合型阳性重组菌株GS115/pPIC9K-S1 His Muts。将重组菌株在1%甲醇中进行诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,IBV S1基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的分子量约为76 000,能与IBV阳性血清特异性结合,表达的蛋白占上清中总蛋白量的12.5%。     

重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化研究

[目的]研究重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化.[方法]通过设计、构建Jztx-Ⅲ/pPIC9k表达载体,经电转化、甲醇诱导后使敬钊毒素在毕赤酵母GS115中进行表达,并利用C-端6×His标签进行分离纯化.[结果]Jztx-Ⅲ可以在毕赤酵母GS115中高效表达,经亲和层析纯化后其产量可达到95 mg/L.[结论]该试验结果解决了敬钊毒素资源有限产量较低的问题.     

响应面法优化重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件

[目的]对重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件进行优化。[方法]以重组毕赤酵母GS115为研究对象,通过单因素试验确定最佳产酶条件,并采用响应面试验确定3个因素的最佳水平。[结果]最佳产酶条件为:培养温度28℃,培养pH 6.5,摇床转速210 r/min,培养基装液量100 ml。响应面试验确定3个因素即装液量、甲醇添加量和pH最佳值分别为103.18 ml、1.77%和6.69;在此条件下,β-甘露聚糖酶的活力最大值为4 917.5 U/ml。[结论]验证试验证明模型预测值准确、可靠,为重组毕赤酵母菌的合理开发利用提供了依据。     

重组植酸酶appA-2QN在毕赤酵母中的高效表达

对来源于大肠杆菌的植酸酶基因app A进行突变获得植酸酶基因突变体app A-2QN,利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后,该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量,降低植酸酶的生产成本,对表达该酶的重组酵母菌GS115/app A-2QN进行了高密度发酵研究,通过控制发酵过程中碳源(甘油)的添加使得菌体生长达到一定密度,从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段,发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量,利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明,在5 L发酵罐中进行高密度发酵147 h后,菌体浓度OD600nm达到313,通过将甲醇浓度控制在2.5%左右,经过诱导102 h后,蛋白达到了较高的表达量,为7.06 g/L,酶活性(发酵效价)为2.03×105U/m L。结果表明,通过高密度发酵提高了产植酸酶app A-2QN的酵母工程菌的细胞生长密度和蛋白质表达量,揭示该重组酵母菌株具有良好的表达稳定性。     

糖化酶工业株的鉴定及糖化酶基因的克隆

对4种糖化酶工业株的rDNA片段进行克隆,在对比其rDNA-ITS1序列与GenBank数据库的基础上,结合形态学观察对菌株进行了鉴定。结果显示,4种菌株分别为黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉和灰色小克银汉霉。通过Me-gAlign得到的进化树表明,前3种菌株亲缘关系较近,三者与灰色小克银汉霉的亲缘关系较远。进一步克隆了黑曲霉、无花果曲霉和米曲霉的糖化酶基因,并在毕赤酵母中实现了分泌表达。     

里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

摘要：以里氏木霉（Trichoderma reesei）RNA为模板，采用RT-PCR扩增的方法获得不带自身信号肽man1基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pPIC9K-man1，重组质粒SacⅠ线性化后用PEG（聚乙二醇）法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中，通过PCR和表型鉴定表明man1基因已经整合到毕赤酵母染色体上。经大量筛选，获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株RMAN23。将此菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵，测定酶活最高达470IU /mL，同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

毕赤酵母GS115/phyA产植酸酶诱导条件研究

植酸酶是催化植酸及其盐类水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称。在饲料工业和食品工业中添加植酸酶可分解植酸磷为可利用磷，同时消除抗营养作用，提高蛋白质、微量元素的利用率，有重要的应用价值。自然界存在广泛可分解植酸的菌株，