宁夏枸杞甜菜碱乙醛脱氢酶（LbBADH2）的克隆与序列分析

以宁夏枸杞为试验材料,利用同源克隆技术,设计简并引物,克隆得到一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因.该基因全长cDNA为1 527个碱基,编码508个氨基酸,编码区两侧翼分别具有5＇UTR （47 bp）和3＇UTR（129 bp）.在推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽（VrlElGGKSP）以及与酶功能有关的半胱氨酸残基（C）.进化分析表明,它与番茄甜菜碱醛脱氢酶亲缘关系最近,与其他藜科植物亲缘关系较远.该基因的获得有助于理解枸杞这一盐生植物耐盐机理,为培育新的耐盐枸杞奠定理论基础.     

外源甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因对小麦合成甜菜碱的影响

通过毛细管电泳,对转入山菠菜BADH基因的小麦品系T1,T4,T6及受体石4185的甜菜碱含量进行了检测,发现在胁迫与未胁迫条件下,T1,T4,T6的甜菜碱含量均高于受体石4185,T1,T6与受体差异显著,T4与受体差异不显著.说明外源BADH基因可提高小麦中甜菜碱含量,但在不同品系中的表达有一定差异.     

诱导型启动子Rd29A引导的植物表达载体的构建

全球20%的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁,抗盐育种具有重要意义.针对常规育种周期长等明显的局限性,利用抗盐转基因可以迅速获得抗盐材料,明显缩短育种周期.利用PCR技术克隆获得Rd29A这一干旱、盐碱等逆境诱导表达的特异性启动子,与叶绿体转运肽和甜菜碱醛脱氢酶基因构建pBinRdMCS重组质粒,用于林木转化.通过克隆Rd29A启动子构建逆境诱导的高效表达载体,可对林木抗盐转基因育种提供理论指导. 图5参8     

利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T₁籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T₁代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg^-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。     

BADH/pepB双价基因无选择标记表达载体转化苜蓿的初步研究

选用公农1号紫花苜蓿,以5～7d莆龄的无菌子叶为外植体,通过农杆菌介导法将含有甜菜碱醛脱氢酶(BADH)和酸性蛋白酶(pepB)双价基因的无选择标记表达载体导入苜蓿子叶中,并用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选,得到抗盐碱转化植株.碱性盐浓度48mmol/L宜于子叶愈伤诱导,有利于转化植株的获得.对转化植株进行PCR检测,初步证明目的基囚序列已经整合剑苜楷基因组中.移栽成活的13棵碱性盐抗性植株经PCR检测有3棵植株呈阳性.     

番茄BADH2基因转化水稻

用分子生物学手段,构建含番茄BADH2基因的过表达载体,通过农杆菌介导的方法将其导入日本晴幼胚诱导的愈伤组织,获得了303块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织。获得1 059个转化植株。随机选择115个T0植株进行Hyp离体叶片筛选,结果表明,绝大多数植株均呈抗性,并且与PCR检测结果相吻合,说明T0植株中不存在假阳性。     

转BADH基因花生幼苗抗盐性研究

[目的]为提高花生幼苗的抗盐性和BADH基因在花生耐盐基因工程中的应用提供试验依据。[方法]以根癌农杆菌LBA4404为转化受体菌,pCGⅡ（Km^1）为表达载体,将BADH cDNA导入花生,并通过测定盐胁迫下花生幼苗的根冠鲜重、细胞膜相对电导率和叶绿素含量研究转化植株的耐盐性。[结果]PCR检测结果表明转化植株有1301 bp目的带,阴性对照植株无目的带。对阳性植株进行Noiahem杂交,结果表明BADH基因已整合到转化植株的基因组中,并可以正常表达。盐胁迫下,检测组植株的根冠鲜重比对照组植株显著增加;检测组植株的相对电导率与对照组植株差异显著,转基因植株的相对电导率均低于对照植株;对照组植株的叶绿素含量比检测组植株低且差异显著。[结论]转BADH基因花生比对照植株表现出更强的耐盐性。     

农杆菌介导BADH耐盐基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种费乌瑞它微型薯为外植体,采用农杆菌介导法将BADH耐盐基因导入马铃薯中,优化了影响遗传转化的因素,包括激素浓度、脱菌抗生素浓度、共培养时间、筛选剂浓度等。共获得30株PPT抗性植株,PCR检测10株为阳性植株,Southern检测4株为阳性植株。生理检测表明植株在0.7%NaCl浓度下耐盐性相对较高。证明外源基因已经整合到植物的基因组上。     

小麦甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的转化及表达

利用农杆菌介导法将小麦甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)导入了烟草(Nicotiana tobaccum L.)NC89品种,该基因由35S启动子控制,PCR和PCR-Southern证明外源BADH已导入烟草基因组,平均转化频率80%;低温处理后转基因植株中BADH活性差异较大,最高的达到4.8 nmol·mg-1 protein·min-1,而在有些转基因植株中没有检测到BADH活性.     

pCAMBIA2300-betA-BADH双价基因植物表达载体的构建

将载体pCAMBIA2300-35s-OCS进行改造,增加了酶切位点Sac Ⅰ,之后,PCR扩增编码胆碱脱氢酶(CDH)的基因并用Sma Ⅰ和Xba Ⅰ将其与改造后的pCAMBIA2300-35s-OCS连接,得到单价植物表达栽体p2300-gz-betA.再通过Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、Sac Ⅰ等酶切位点将编码甜菜碱醛脱氧酶(BADH)的基因及其启动子和终止序列连接到栽体p2300-gz-betA上,最终得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体,并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404.betA和BADH是编码甜菜碱合成途径的两个关键酶的基因(CDH和BADH),也是近年来研究较多的耐盐基因,其双价植物表达栽体应用于遗传转化后,有望进一步提高转基因植物的耐盐性.