小麦光腥黑粉菌转化子最适固体培养基的筛选

为了筛选小麦光腥黑粉菌转化子最适培养基, 以提高小麦光腥黑粉菌转化子生长速度, 选取了3个菌落形态不同的转化子(ZHZ-1, ZHZ-2, ZHZ-3)进行培养试验?用6 mm打孔器打取菌饼, 将菌饼置于9种培养基上16℃避光培养?观察?测量小麦光腥黑粉菌转化子的菌丝生长情况?菌落直径等主要指标, 结果表明, 9种培养基中, 3种转化子都是在完全培养基(complete medium, CM)上生长状况最好, 菌丝生长速度最快?ZHZ-1转化子在CM培养基上菌落圆形, 有褶皱, 产生大量白色菌丝, 生长速度快?ZHZ-2转化子菌落圆形, 产生大量白色菌丝, 生长速度快?ZHZ-3转化子菌落云纹状, 有褶皱, 产生大量白色菌丝, 生长速度快?     

含正确木聚糖酶基因转化子的活性筛选

基因工程中,人们很难有效地筛选到带有正确基因的转化子。本文将木聚糖酶基因与pET20b重组,转化BL21(DE3) 大肠杆菌,选取10个转化子,放入0.5ml LB培养基过夜培养,补加9.5ml培养基2.5h后诱导,收集并冻融裂解细胞,检测酶活性,7个转化子酶活性接近或高于阳性对照菌落,认定为阳性转化子,经DNA测序证明基因序列正确。与以往检测基因不同,本研究直接检测转化子酶活性,筛掉不能表达活性酶的突变基因,称为活性筛选方法;其次,用冻融裂解细胞方法简化裂解过程,便于自动化高通量操作;最后,比较初筛酶活性,筛选高酶活转化子。这个过程只要2-3天,具有快速简便特点。     

转LdOA1基因果蝇品系GSTs基因表达及对溴氰菊酯胁迫响应

舞毒蛾是重要林业食叶害虫,揭示其G蛋白偶联受体介导G蛋白对GSTs的调控,这对于挖掘分子靶标开发新型杀虫剂具有重要意义。本文构建转LdOA1基因果蝇载体,获得表达LdOA1基因果蝇品系,分析了转基因果蝇GSTs基因表达量及对溴氰菊酯胁迫的响应,为明确昆虫OA1基因功能提供理论依据。通过传统的酶切-连接方法构建重组载体pUAST-attB-LdOA1,采用转基因技术构建表达LdOA1基因的纯合果蝇品系,利用PCR技术验证转基因果蝇品系,并运用实时荧光定量RT-PCR技术测定转基因果蝇GSTs Delta家族基因表达量及低浓度溴氰菊酯胁迫对GSTs基因表达量的影响。PCR扩增条带显示转LdOA1基因果蝇品系均能检测到453bp目的基因条带。与非转基因果蝇相比,转LdOA1基因果蝇品系中GSTs Delta家族基因(除GSTd4和GSTd7)均上调表达,为非转基因组1.01~3.27倍。低浓度溴氰菊酯胁迫6h,非转基因果蝇GSTd6和GSTd10基因被显著诱导激活,而其他GSTs基因被显著抑制,抑制率为6.48%~95.84%,胁迫12~72h,GSTs基因(除GSTd1和GSTd10外)均被显著抑制。低浓度溴氰菊酯胁迫转基因果蝇GSTs表达量变化趋势与非转基因果蝇基本一致,但转基因果蝇品系GSTs表达量显著高于非转基因果蝇品系(除12~48h GSTd1和GSTd10),且胁迫6h表达量最大。这些结果表明LdOA1基因可能介导G蛋白信号通路调控下游GSTs Delta亚家族基因表达响应溴氰菊酯胁迫。      

农杆菌介导油菜黑胫病菌遗传转化

为优化建立农杆菌介导的油菜黑胫病菌遗传转化技术体系，以携带潮霉素磷酸转移酶基因的pCH-sGFP 为载体，农杆菌LBA4404为介体，对油菜黑胫病菌的分生孢子进行转化。油菜黑胫病菌的最佳转化体系为:分生孢 子浓度106个/mL，农杆菌OD600值0.6，乙酰丁香酮浓度200 μmol/mL，pH 5.8，25℃，共培养4 d，获得120～161个转化 子。随机选取26个转化子连续培养5代能够稳定遗传，绿色荧光蛋白基因gfp 表达的菌丝和孢子可见绿色荧光。 PCR鉴定发现T-DNA 已整合进油菜黑胫病菌基因组中，Southern blot鉴定发现T-DNA以单拷贝的形式插入黑胫病 菌中,转化子均能够稳定遗传。建立油菜黑胫病菌遗传转化体系为该病菌的致病机制研究和功能基因分析奠定了 基础。     

马铃薯疮痂病菌致病相关基因的克隆及表达

 A pathogenic-related gene nec1 was cloned in Streptomyces scabies CPS-1, potato scab strain. Analysis results showed that the length of open reading frame(ORF) for nec1 gene was 666 bp, and the GC content was 54.2%. Sequence alignment indicated that a 650 bp up-stream sequence shared 91% similarity with IS 256 family transposase nucleotide sequences by BLASTn searches against GenBank. The segments obtained by PCR amplification were digested by enzymes SphⅠand SacⅠ, and linked to the expression vector pIJ702. The recombinants were transformed into nonpathogenicity strain Streptomyces lividans 66 TK24. Bioas-say results suggested that the transformants possessed the same symptoms as pathogenic strain on potato tuber slices and radish seedlings, which implied that nec1 gene was associated with the pathogenicity of S. scabies CPS-1.     

苜蓿轮枝菌的生物学特性分析及ATMT遗传转化体系的建立

 为了揭示苜蓿轮枝菌Verticillium alfalfae的生物学特性及其致病机理,在室内条件下测定不同温度、pH值、碳源和氮源对菌株Ms198的生长速率和产孢量的影响,同时利用农杆菌转化法(Agrobactirium tumfacience-mediated transformant,ATMT)将带有潮霉素(Hygromycin,Hyg)抗性标记和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因的双元载体转入苜蓿轮枝菌的分生孢子,获得147株阳性转化子,以野生型菌株为对照,对挑取的15株阳性转化子的菌落形态、生长速率、产孢量、孢子萌发率、粗毒素分泌量和致病力进行研究。结果表明,苜蓿轮枝菌具有较宽的温度和酸碱度适应范围,最适生长和产孢温度分别为25 ℃和20 ℃,最适生长pH值为6 ~ 9,最适产孢pH值为9。可以利用多种碳、氮源,最适生长的碳、氮源分别为可溶性淀粉和牛肉膏,最适产孢的碳、氮源分别为D-牛乳糖和胰蛋白胨。与野生型菌株相比,15株供试转化子中有66.67%的转化子在菌落形态方面与野生型菌株无明显差别,而其生长速率、产孢量和孢子萌发率均有不同程度的降低。在产毒能力和致病力方面,1株转化子的粗毒素分泌量显著高于野生型菌株,9株显著低于野生型菌株,其余5株与野生型菌株无显著差异;4株转化子的致病力显著低于野生型菌株,其余11株转化子的致病力与野生型菌株均无显著差异。研究结果表明,转化子的生物学特性以及产毒能力和致病力,随外源基因插入位点的随机性而有所变化。     

原生质体法介导真菌遗传转化的研究进展

原生质体法介导真菌遗传转化体系是实现大规模随机、定点突变和菌种改良的方法之一,为研究真菌致病性和侵染机制奠定了基础。原生质体法构建转化体系的步骤包括原生质体的制备、转化与再生,其中关键是原生质体的制备,通常采用酶解法破除细胞壁获得原生质体,其获得率直接影响转化效率。转化通常借助于聚乙二醇(PEG)介导、电击或限制性内切酶法完成,其中PEG介导的原生质体转化法较传统,技术较成熟;电击法操作较简单;限制性内切酶(REMI)介导的整合转化,因其转化效率较高,可产生大量稳定的转化子,正被越来越多地应用于丝状真菌的遗传转化。     

一种评价甘蓝枯萎病菌转化子致病力的方法

为建立甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans)转化子致病力评价方法,从接种方法、甘蓝品种、苗龄、病原菌接种体浓度等几方面探索,建立了一种评价甘蓝枯萎病菌转化子致病力差异的体系。结果表明:蘸根法和伤根法均适于甘蓝枯萎病菌转化子致病力的评价,其中伤根法更优;其他适合甘蓝枯萎病菌转化子致病力评价的因素有:甘蓝品种为‘中甘21’,苗龄为三叶期,甘蓝枯萎病菌孢子悬浮液浓度为孢子含量1×106个/mL。该致病力评价方法的建立为甘蓝枯萎病菌转化子致病力衰弱或增强突变体的筛选提供了方法支持,也为下一步尖孢镰刀菌致病机理的解析奠定了基础。     

A rapid,novel and high-throughput identification of putative bell pepper transformants generated through in planta transformation approach

The recent progress on bell pepper transformation through in planta approach is incredibly simple with high transformation efficiencies in indigenous varieties. This method produces chimeric primary transformants (T₀) hence, a large number of T₀ plants and an efficient high throughput screening strategy is necessary to be developed. In the present investigation, we have standardized a rapid and highly efficient method of screening putative bell pepper transformants. Bell pepper transformants harbouring gfp genes was developed using in planta approach and 1050 etiolated T₁ seedlings were screened using fluorescent microscope to select GFP positive plants. The molecular analysis such as, gene specific PCRs, semiquantitative RT-PCR and Southern blots analysis corroborated the transgene integration in selected T₁ transformants. Based on progressive selection strategy, the transformation efficiency was 27.4% in gfp screened plants. The fluorescence based screening is viable, rapid, requires minimal labour, expense, and expertise with less percent of non-transformant escapes; further, this method can be extended from bell pepper to other crops to identify putative transformants developed through in planta approach.