真核表达NDV F基因重组质粒的构建及其在CEF细胞中的转染

通过PCR方法自含NDVZF基因的克隆质粒中扩增NDVF基因 ,将其与真核表达载体pcDNA3..1/V5_His_TOPO重组。经核酸内切酶酶切 ,阳性克隆鉴定准确无误 ,核酸序列测定结果与原始基因比较 ,同源性大于 99% ,启始密码和终止密码未出现变异 ,将该重组质粒命名为pcDNANDVZF。将pcDNANDVZF在脂质体作用下转染CEF细胞 ,用间接免疫荧光试验检测 ,结果证明pcDNANDVZF可在CEF细胞中大量表达F蛋白。     

两株新城疫病毒的分离鉴定及免疫试验研究

通过对两株新城疫病毒的分离、鉴定，以及对分离株病毒的驯化、培养和灭活疫苗的研究，经与新城疫(LaSota株)油乳剂灭活疫苗的对比实验和与LaSota株混合制苗后均证实了与新城疫(LaSota株)油乳剂灭活疫苗在免疫原性与免疫后的抗体滴度、抗体持续期等方面均表现出一定的差异。     

鸡新城疫病毒B_(95)株的RT-PCR检测方法研究

本试验设计了一对B95 株的特异引物NDV -P1/P2,探讨了对其进行RT-PCR检测的可行性。结果证明 ,用该引物可以扩增出一条310bp的特异核酸带 ,敏感性为0.0043ng/ul。     

应用生物素标记的NDV－cDNA探针检测感染尿囊液中NDV－RNA的初步研究

本文应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从构建的新城疫病毒（ＮＤＶ）ｃＤＮＡ文库中扩增含编码Ｆ糖蛋白前体──Ｆｏ酶切位点序列的３５９ｂｐ的Ｆ蛋白基因ｃＤＮＡ片段。将此３５９ｂｐｃＤＮＡ片段经光敏生物素标记后,即成ＮＤＶ－ｃＤＮＡ探针。该探针能特异性地从感染的尿囊液中检测出ＮＤＶ强毒株和疫苗毒株的基因组ＲＮＡ,而不与ＩＢＤｖ－ｄｓＲＮＡ、ＡＩＢｖ－ｓｓＲＮＡ、ＥＤＳ７６－ｄｓＤＮＡ、ＭＤＶ－ｄｓＤＮＡ,ＦＰＶ－ｄｓＲＮＡ及ＡＩＬＶ－ｄｓＤＮＡ发生交叉杂交反应。试验结果表明：尽管该探钎含有编码Ｆｏ蛋白酶切位点序列的碱基顺序,但它还是不能把ＮＤＶ的强、弱毒株区分开。这说明ＮＤＶ强、弱毒株比区域内的碱基存在着相当大的同源性。不过,此探针对ＮＤＶ来说具有特异性,这就为ＮＤＶ的诊断技术开创了基因水平检测的新途径。     

鸡新城疫云南分离株HN基因序列测定和分析

用RT—PCR法对分离自云南省的2株鸡新城疫病毒(编号YN—C1、YN—C2)进行HN基因的扩增和克隆．并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明：2毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为l716nt；二者之间的核苷酸同源性为95．3％，氨基酸同源性为95．8％；YN—C1毒株与参考毒株GD／1／98／Go核苷酸、氨基酸同源性均最高，分别为97．9％和97．6％；YN—C2毒株与参考毒株JS／5／01／Go核苷酸同源性最高为98．5％，而与参考毒株JS／3／98／Go氨基酸同源性最高为98．1%。     

“芪蓝饮”及不同提取成分对NDV在鸡胚成纤维细胞中增殖的影响

为评价新兽药"芪蓝饮"及其不同提取成分的体外抗病毒活性,本试验通过细胞病变抑制法和MTT比色法检测了各提取成分对新城疫病毒(NDV)感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程的影响。结果显示,在3种加药方式中"芪蓝饮"原药(QLY)直接杀灭NDV的作用最强,其抑制率最高为128.85%;原药总多糖(TPS)干扰NDV的增殖作用最强,其抑制率最高为130.23%;原药总萜类(TT)直接杀灭NDV的作用最强,其抑制率最高为146.15%;板蓝根总生物碱(RIA)及其水溶性部位(RIAw)和酸性部位(RIAa)对抗NDV的方式是多环节的。综上所述,"芪蓝饮"及其提取成分表现出较强的干扰NDV增殖和直接杀灭NDV的作用,而阻断作用稍弱。     

应用逆转录套式PCR检测新城疫病毒核酸

选择DNV融合蛋白保守的编码区域,设计并合成了一对外引物和一对内引物,建立并优化了检测新城疫病毒核酸的逆转录套式PCRI地,通过检测NDV感染的实验客观存在病料和临床病料,结果表明,逆转录套式PCR法最低能鉴别出约0.3pg的NDV RNA,攻毒后第8天还能从非免疫鸡和SPF鸡泄殖腔拭子中检出DNV,第8天非免疫鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为5/10,第8天SPF鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为6/10,对非免疫鸡和SPF鸡的泄殖腔中NDV最佳检出时间均在攻毒后第5天。逆转录套式PCRY应运地临床样品中DNV的最大检出率为6/7,经核酸杂交验证,该法具有很高的特异性和敏感性,也比较简便快速,为从分子水平探讨NDV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。     

共表达NDV F、IBDV VP0基因重组鸡痘病毒中和抗体消长规律

将海兰褐蛋雏鸡随机分为对照组、肌肉注射组、刺种Ⅰ组和刺种Ⅱ组,用共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒进行免疫,对照组刺种生理盐水,在免疫后的第7,14,21,28,35,42,49 d和56 d采血,分离血清,用固定病毒稀释血清法测血清中抗FPV,NDV,IBDV的中和抗体效价.经分析,抗FPV中和抗体效价及抗NDV中和抗体效价免疫后14 d达到高峰,28 d后下降幅度不明显,42 d时仍保持一定水平;抗IBDV中和抗体效价免疫后21 d达到高峰, 28 d后下降幅度不明显,42 d时仍保持一定水平.     

中西药抗鸡新城疫病毒的体外试验研究

应用细胞培养的方法观辑了40味中药和4种西药抗鸡新城疫病毒的体外活性。结果表明，40味中药中15味有一定的治疗效果，药物选择指数在2．29—13．3之间；18味有一定的预防效果，药物选择指数在2．21—69．4之间；4种西药中仅利巴韦林有治疗和预防效果，药物选择指数分别为433．3和343．7。     

新城疫病毒F、NP、M和HN基因在昆虫细胞内的共表达

为构建杆状病毒转移载体，通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的StuⅠ位点和NP基因上的XbaⅠ位点进行突变，扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段，将其克隆到pMD18-T载体，再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病毒转移载体pAeAB4上，F基因和M基因均在p10启动子的操控之下，NP基因和HN基因构建到两个polyhedrin启动子下游，构建重组杆状病毒转移载体pAeAB4-F-NP-M-HN。pAeAB4-F-NP-M-HN与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rBae-F-NP-M-HN。重组杆状病毒感染Sf9细胞，72h后收集细胞和培养上清。Western blot分析显示：M、NP、F和HN蛋白在培养上清中得到了共表达，大小与预期结果一致；感染细胞内只检测到了HN蛋白的表达。这表明M、NP、F和HN蛋白在昆虫细胞内共表达可以自我装配成病毒样颗粒，并且以出芽的方式释放到培养基中。该重组杆状病毒的获得为研究新城疫病毒各结构蛋白之间的相互作用和确定病毒粒子出芽的驱动力等方面奠定了基础。