肉毒毒素重组抗原表达系统研究进展

肉毒中毒是肉毒杆菌引起的一种致死性的神经麻痹性疾病,应对内毒中毒的最有效方法是预防或疫苗接种,肉毒毒素Hc段是研制亚单位疫苗的首选.通过基因重组技术能够将肉毒毒素Hc片段在大肠杆菌或酵母表达系统中进行大规模表达.阐述了这2种表达载体在肉毒毒素亚单位疫苗的研制及发酵生产情况.     

东北虎γ-干扰素基因的克隆、生物信息学分析及其在毕赤酵母中的表达

本试验旨在通过克隆东北虎γ-干扰素(IFN-γ)基因,研究其分子特征并预测蛋白生物学功能,为后续研究干扰素抗病毒活性做前期准备。通过RT-PCR从ConA诱导过的东北虎血淋巴细胞中扩增东北虎IFN-γ基因并测序,应用生物信息学方法进行序列分析。结果表明:东北虎IFN-γ编码区由504个核苷酸组成,共编码167个氨基酸,蛋白相对分子质量为19.59 ku,等电点为9.03,所编码的蛋白为碱性亲水性蛋白,其中前23个氨基酸可能为信号肽,IFN-γ编码蛋白保守结构域为IFN-γ超家族,且存在跨膜结构,其中1-6位氨基酸为胞内区域,7-28位氨基酸为跨膜区域,29-167位氨基酸为胞外区域;IFN-γ编码蛋白二级结构主要以α-螺旋(58.08%)和无规则卷曲(33.53%)为主,存在5个潜在的B细胞抗原表位,3个潜在的N-糖基化位点;分子进化分析显示,东北虎IFN-γ与GenBank上发表的东北虎、非洲狮、金钱豹、美洲狮、猎豹、家猫、加拿大猞猁、野猪等的核苷酸相似性为80.4%~99.8%,氨基酸相似性为70.5%~100%,东北虎IFN-γ与非洲狮、金钱豹亲缘关系最近,美洲狮、猎豹、家猫、猞猁次之,野猪最远。通过合成改造后的东北虎IFN-γ基因,构建能表达IFN-γ蛋白的重组质粒pPIC9K-IFN-γ,将其导入高效表达系统-毕赤酵母中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达蛋白的分子量约17.8 ku,与预期大小相符,表明东北虎IFN-γ成功表达。     

ECM 830电穿孔仪在毕赤酵母电转化中的应用

用线性化质粒与酵母细胞混合后进行电转化,培养细胞,菌体计数,通过计算转化率探索ECM 830电转仪的转化条件,确定出毕赤酵母电转化最佳条件,低电压模式;电压300 V;脉冲长度15 ms;脉冲次数为1次;为ECM 830电转仪在酵母转化中的应用提供依据.     

重组牛皮蝇素A蛋白的免疫试验

用由毕赤酵母表达的皮蝇素A（Hypdermin A，HA）蛋白分别免疫新西兰大白兔和牦牛，了解该蛋白免疫效果。用两种不同分子量的重组HA蛋白分别免疫新西兰大白兔1次和2次，ELISA测其抗体消长规律。结果表明，3周后抗体水平达到峰值，后缓慢下降。50KD蛋白免疫效果较30KD蛋白好，差异非常显著（P〈0．01）。用其中50KD的重组HA蛋白分别在7月和9月免疫自然感染牛皮蝇蛆病牦牛，观察感染率和感染强度，ELISA测其抗体消长规律。结果表明，7月免疫组与9月免疫组感染率分别为83．3％和36．3％（对照组为55．5％）；平均感染强度分别为6．5和4．2（对照组为13．0），差异不显著（P〉0．05）。免疫后，抗体水平上升，3个月后缓慢下降。9月免疫组免疫效果较7月免疫组好，三组抗体水平差异非常显著（P〈0．01）。上述研究结果为防治牛皮蝇蛆病疫苗的深入研究和实践运用提供了参考依据。     

毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白

建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（Hypodermotin A，HA）的技术，并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上，构建了重组转移质粒pPIC9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后，用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0．5％甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白，培养3d后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测，所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western—blotting表明，该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示，该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明，甲醇浓度在0．5％～1％、溶氧量在70％以上、诱导2～3d的情况下表达产量最高，达1500mg／L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆痛疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。     

Gene cloning of porcine adiponectin gene from adipose tissue and construction of its eukaryotic expression vector

To clone adiponectin (ADPN) gene from Shaziling porcine adipocyte and construct its eukaryotic expression vector, total RNA was extracted from subcutaneous fatty tissue. One pair of specific primers was designed by Primer 5.0 software according to the sequence of ADPN gene of porcine available in GenBank. The ADPN gene was amplified by PCR from cDNA and cloned into pMD18‐T vector to construct recombinant clonal vector pMD‐ADPN, sequenced and analysed. A recombinant expression plasmid pPICZaA‐ADPN was constructed by subcloning the cloned ADPN gene into the linearized pPICZaA vector. Then, the plasmid pPICZaA‐ADPN was expressed in Pichia pastoris (GS115) by electrotransformation. Western blot and Bradford analysis were used to determine the target protein induced by methanol. Results showed that the genome size of ADPN was 732 bp and encoded 244 amino acid, the nucleotide sequence of ADPN shared 100% identity with that of porcine available in GenBank. Western blot and Bradford analysis showed that the recombinant ADPN was expressed in GS115 correctly and has certain immune activity. The expression level of ADPN was 28.5 μg/ml. In conclusion, the recombinant ADPN could express in eukaryotic expression vector pPICZaA‐ADPN constructed in this study effectively.     

重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化研究

[目的]研究重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化.[方法]通过设计、构建Jztx-Ⅲ/pPIC9k表达载体,经电转化、甲醇诱导后使敬钊毒素在毕赤酵母GS115中进行表达,并利用C-端6×His标签进行分离纯化.[结果]Jztx-Ⅲ可以在毕赤酵母GS115中高效表达,经亲和层析纯化后其产量可达到95 mg/L.[结论]该试验结果解决了敬钊毒素资源有限产量较低的问题.     

人C型溶菌酶发酵与分离纯化工艺的研究

[目的]研究毕赤酵母菌株(Pichia GS115)表达人C型溶菌酶(H-LYZ)的发酵与分离纯化的工艺.[方法]探讨酵母生长规律,研究不同菌体浓度、不同诱导时间对蛋白产量的影响,并且探讨不同pH条件对DEAE-SepharseFF和CM-Sepharose FF层析分离纯化目标蛋白的影响.[结果]毕赤酵母菌株表达H-LYZ的最佳发酵条件为:发酵24h用浓度1％甲醇诱导,以后每12 h用浓度1％甲醇诱导,共6次,在此条件下可获得高产量目标蛋白.DEAE-Sepharose FF和CM-Sepharose FF分离纯化目标蛋白的最佳pH分别为6.65和6.50.[结论]该研究可为人C型溶菌酶的工艺化生产提供理论指导.     

响应面法优化重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件

[目的]对重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件进行优化。[方法]以重组毕赤酵母GS115为研究对象,通过单因素试验确定最佳产酶条件,并采用响应面试验确定3个因素的最佳水平。[结果]最佳产酶条件为:培养温度28℃,培养pH 6.5,摇床转速210 r/min,培养基装液量100 ml。响应面试验确定3个因素即装液量、甲醇添加量和pH最佳值分别为103.18 ml、1.77%和6.69;在此条件下,β-甘露聚糖酶的活力最大值为4 917.5 U/ml。[结论]验证试验证明模型预测值准确、可靠,为重组毕赤酵母菌的合理开发利用提供了依据。     

重组植酸酶appA-2QN在毕赤酵母中的高效表达

对来源于大肠杆菌的植酸酶基因app A进行突变获得植酸酶基因突变体app A-2QN,利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后,该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量,降低植酸酶的生产成本,对表达该酶的重组酵母菌GS115/app A-2QN进行了高密度发酵研究,通过控制发酵过程中碳源(甘油)的添加使得菌体生长达到一定密度,从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段,发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量,利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明,在5 L发酵罐中进行高密度发酵147 h后,菌体浓度OD600nm达到313,通过将甲醇浓度控制在2.5%左右,经过诱导102 h后,蛋白达到了较高的表达量,为7.06 g/L,酶活性(发酵效价)为2.03×105U/m L。结果表明,通过高密度发酵提高了产植酸酶app A-2QN的酵母工程菌的细胞生长密度和蛋白质表达量,揭示该重组酵母菌株具有良好的表达稳定性。