微生物菌群培养组学在动物医学中的应用

实验室条件下可培养的微生物约占自然界中微生物总数的1%，这限制了人们对99%未知微生物的认识和利用，而研究表明，那些“不可培养的微生物”是可以被开发和利用的，未能被纯培养的微生物才是未知微生物的主体。微生物培养组学探索利用多种培养条件和长时间的培养，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）和16S核糖体RNA（rRNA）测序可以大规模鉴定各种微生物，同时利用全基因组测序和宏基因组测序手段对未知微生物进行深入分析。本文综述了国内外近年来微生物菌群培养组学在反刍动物胃肠道、禽类盲肠及家畜鼻腔微生物菌群研究中的最新进展，探讨将动物体内菌群培养组学方法应用于动物疾病防治领域的可行性。作为一个新兴的研究方法，尽管该培养组学还存在一些不够成熟的方面，但它的发展前景十分广阔，微生物菌群培养组学方法和其他研究方法的互补已经逐渐成为发展兽医微生物学新的突破口。     

寒胁迫诱导灰木相思无性系差异蛋白的表达

本实验提取寒胁迫前后的灰木相思组培苗的水溶性蛋白进行双向电泳和质谱鉴定,分析在寒胁迫条件下蛋白质组的变化。利用ImageMaster 5.0软件分析比较,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定差异蛋白点的肽质量指纹图谱,通过Mascot软件查询Swiss-Prot等数据库,鉴定得到4个显著差异蛋白点,R7、R15、R20表现为上调表达,R17表现为下调表达。结果表明:在寒胁迫条件下灰木相思组培苗存在明显的蛋白质表达差异。     

The Application of Microbiome Culturomics in Veterinary Medicine

Under laboratory conditions, the number of cultured microorganisms accounts for about 1% of the total number of microorganisms in nature, which limits people's understanding and utilization of 99% of the unknown microorganisms. However, relevant researches show that those "uncultured microorganisms" can be developed and utilized, and the uncultured microorganisms are the main body of the unknown microorganisms. The microbial culturomics explored the application of multiple culture conditions and long-term culture, it was combined with Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) and 16S ribosomal RNA (rRNA) sequencing to identify all kinds of microorganisms on a large scale. At the same time, whole-genome sequencing (WGS) and Metagenomics sequencing technology were used to analyze unknown microorganisms in depth. In this paper, the latest progress of culturomics in the ruminant gastrointestinal tract, poultry cecum, and livestock nasal microflora in recent years was reviewed, and the feasibility of applying the method of microflora culturomics in animal disease prevention and control was discussed. As a new research idea, culturomics has some immature aspects, but its development prospect is very broad. The complementary of microflora culturomics and other research methods have gradually become a breakthrough in the development of veterinary microbiology.     

光系统Ⅱ抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗叶绿体蛋白质组变化分析

为了研究除草剂作用机理,用光系统Ⅱ抑制型除草剂阿特拉津（Atrazine）处理小麦幼苗,用2-DE技术和生物质谱方法,分析了叶绿体蛋白质组的变化。结果发现,在10mg·L-1浓度处理时,有7个叶绿体蛋白质斑点（斑点1,50kDa/PI8.1;斑点2,41kDa/PI8.4;斑点3,41kDa/PI7.6;斑点4,23kDa/PI7.1;斑点5,31kDa/PI5.0;斑点6,35kDa/PI8.9;斑点7,14kDa/PI8.1）丢失。对7个发生变化的斑点利用MALDI-MS方法,于NCBI进行数据查询,其中,有6个叶绿体蛋白质归属得到鉴别,它们是Calvin循环中,固定CO2的RuBPcase的激活酶（2个同工体和1个β型前体）,在H2O氧化裂解中起重要作用的23kDa氧释放蛋白（psbp protein）,在能量转贮中起重要作用的3-磷酸甘油酸激酶和催化HCO3--CO2水合作用可逆反应的碳酸酐酶。研究表明,叶绿体蛋白质组中丢失的6个蛋白质是Atrazine处理的相关蛋白。     

MALDI-TOF-MS用于微生物鉴定的影响因素分析

影响MALDI-TOF-MS微生物鉴定的因素有很多。本研究主要从微生物培养基、培养状态、菌体前处理、上样量等方面进行MALDI-TOF-MS操作技术和方法的探讨。研究结果显示:进行MALDI-TOF-MS细菌鉴定,培养时间在4～24 h之间为佳;尽量选择无色、不含盐的液体培养基;0.1μL菌液是最低鉴定菌量;上样量对结果无影响;对于菌体前处理,除按照标准化前处理程序操作外,也可将菌体加dd H2O制成混悬液进行点靶鉴定,这样更加简便。本研究有助于减少MALDI-TOF-MS操作盲目性,提高鉴定质量,利于操作的规范化和简便化。     

水稻草状矮化病毒侵染寄主水稻差异表达蛋白的鉴定和分析

【目的】对水稻草状矮化病毒（Rice grassy stunt virus,RGSV）侵染寄主水稻后其叶片的差异表达蛋白进行筛选、鉴定和生物信息学分析,为进一步研究RGSV和寄主水稻互作的分子机制提供线索。【方法】采用双向荧光差异凝胶电泳（Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2D-DIGE）和Image Master 2D platinum 7.0分析软件寻找差异表达蛋白,MALDI-TOF-MS（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry）鉴定差异蛋白,利用BioTools软件搜索NCBI数据库,寻找匹配的相关蛋白质和功能查询。采用GOminer软件对差异蛋白进行GO（Gene ontology）聚类分析,KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库分析差异蛋白所参与的生物通路。【结果】建立了RGSV侵染与未侵染水稻的叶片双向荧光差异凝胶电泳图谱,RGSV病株与健株相比,差异倍数大于1.5的差异蛋白质点有173个,其中表达丰度升高的点有72个,表达丰度下降的点有101个,质谱鉴定了44个差异蛋白质点,25个获得成功鉴定,分属于24种蛋白质,包括RGSV的2种蛋白20.6K非结构蛋白和P5蛋白,水稻中的蛋白推定的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基、景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶前体、推定的酪氨酸磷酸酶、HAD超家族水解酶-亚族IA蛋白变体3蛋白、水稻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基结合2-羧基阿拉伯糖醇-1,5-二磷酸复合体、类似C1结构域蛋白以及其他一些功能未知蛋白和假定蛋白。对已鉴定蛋白的生物信息分析显示,差异蛋白涉及氮素固定、氮循环代谢过程、含氮化合物代谢过程、单一生物体代谢过程、代谢过程和生物过程等6个生物学过程,在生物功能上分属7类,包括分子功能、酸胺连接酶活性、酰胺连接酶活性、催化活性、谷氨酸氨连接酶、连接酶活性和形成C-N键的连接酶活性,在细胞组件上,差异蛋白分布于不同的细胞位置,涉及细胞组分、细胞器、细胞、膜结合细胞器、囊（泡）、细胞部分、膜结合囊（泡）、胞内、胞内部分、胞内细胞器、细胞质、胞内膜结合细胞器、细胞质部分、质体、细胞质囊（泡）和细胞质膜结合囊（泡）。KEGG通路分析显示,差异蛋白参与了代谢途径、光合生物固碳反应、碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酸生物合成、丙酮酸盐代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢和氮代谢途径等10个KEGG代谢通路。【结论】RGSV侵染诱导了水稻差异蛋白质表达,获得了一些与RGSV侵染水稻相关的蛋白质分子,差异蛋白涉及到多个功能类别。其中与氮有关的生物学过程和光合作用过程变化较为明显。     

大豆抗疫霉根腐病的蛋白组研究

利用双向电泳及MALDI-TOF-MS技术分析绥农10号真叶接种疫霉菌1号生理小种后的蛋白质组变化。在抗病品种绥农10号叶片中共获得19个差异表达蛋白点, 其中有12个上调表达, 6个下调表达, 1个特异表达(仅在接种后出现)。利用生物质谱分析8个上调表达点、1个下调表达点和1个特异表达点, 最终鉴定得到8个有注释功能的蛋白, 根据功能可分为4类, 第1类为参与新陈代谢的蛋白, 包括二磷酸核酮糖羧化酶的大亚基及前体、琥珀酰-辅酶A;第2类为参与信号传导的蛋白, 包括激酶受体类蛋白、氧化还原酶和半胱氨酸氧化还原酶;第3类为参与细胞内物质运输的蛋白, 包括衣壳蛋白的zeta-3亚基;第4类为转录因子, 是参与茉莉酸介导的F-box蛋白。这些蛋白可为进一步研究大豆抗病机制奠定基础。     

低温对不同基因型黄瓜叶片蛋白质组的影响

 【目的】分离不同基因型黄瓜叶片的低温诱导蛋白,为从蛋白质组角度揭示黄瓜应答低温逆境的调控机制打下基础。【方法】以黄瓜（Cucumis sativus L.）的日光温室品种‘新泰密刺’和露地栽培品种‘津研4号’为试材,采用分步提取法溶解叶片总蛋白质,运用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、质谱分析与检索技术,在100 μmol?m-2?s-1的光照条件下,比较研究低温（15/15℃）和常温（25/18℃）下叶片蛋白质组的差异。【结果】利用提取液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分步提取叶片总蛋白质后,提取液Ⅰ溶解的黄瓜蛋白质较少。对提取液Ⅱ和Ⅲ溶解的叶片蛋白质进行双向电泳后发现,相对于常温处理,低温使‘新泰密刺’的7个蛋白质点特异表达、2个蛋白质点上调表达、2个蛋白质点下调表达、5个蛋白质点未表达;使‘津研4号’的7个蛋白质点特异表达、1个蛋白质点上调表达、4个蛋白质点下调表达、9个蛋白质点未表达。低温下,‘新泰密刺’的蛋白质点3和4 以及‘津研4号’中蛋白质点2的表达量显著高于常温处理,通过MALDI-TOF质谱分析,这3个蛋白质点被鉴定为1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的大亚基。【结论】黄瓜叶片的高亲水性蛋白质含量低;在相同的光照（100 μmol?m-2?s-1）条件下低温对不同基因型黄瓜叶片的蛋白质组均有影响;1,5-二磷酸核酮糖羧化酶可能与黄瓜叶片耐低温有关。     

玉米花粉与花丝早期互作的蛋白质组学分析

 【目的】分离授粉早期玉米花丝的总蛋白质,为从蛋白质组角度揭示玉米花粉与花丝早期的相互作用奠定基础。【方法】以玉米(Zea mays L.)自交系Ga25为试材,采用三氯乙酸-丙酮法提取总蛋白质,运用双向电泳、质谱分析与检索技术,比较自交授粉后1 h和2 h的花丝蛋白质组的差异。【结果】与授粉1 h的蛋白质组相比,在授粉2 h后的蛋白质组中出现28个差异蛋白点,其中,6个蛋白质点特异表达,19个蛋白质点上调表达,3个蛋白质点下调表达;通过MALDI-TOF-MS质谱测序和MASCOT序列分析,注释了23个蛋白质点,其余5个为未知蛋白;功能分类表明,差异蛋白质分别参与细胞壁合成(21.4%)、防御/抗胁迫(17.9%)、细胞组织、蛋白命运、蛋白合成、转录等细胞过程。【结论】在玉米花粉与花丝早期的相互作用过程中蛋白质组有显著的变化,与授粉后1 h相比,授粉后2 h的蛋白质组中大部分差异蛋白呈上调趋势,并有特异蛋白质出现;分泌型过氧化物酶、膨胀素、果胶甲基化酶抑制蛋白、谷胱甘肽转移酶与未知蛋白4可能与玉米花粉和花丝的早期互作密切相关。     

Cd2+对番茄幼苗生长和蛋白质组的影响

以3 d龄番茄幼苗为试验材料, 从生理、生化和蛋白质组角度, 分析0.01~1.00 mmol L^–1 Cd²⁺处理72 h后对幼苗的影响。结果表明, Cd²⁺处理导致幼苗生长严重受抑, 幼苗高度从对照组的4.76±0.50 cm分别降至3.79±0.05 cm (0.01 mmol L^–1 Cd²⁺处理, P<0.01)和1.77±0.15 cm (0.03 mmol L^–1 Cd²⁺处理, P<0.01)。根长度从对照组的6.07±0.04 cm降至4.77±0.58 cm (0.01 mmol L^–1 Cd²⁺处理, P< 0.01)和3.65±0.66 cm (0.03 mmol L^–1 Cd²⁺处理, P<0.01)。叶绿素含量在0.1 mmol L^–1 Cd²⁺处理后开始下降。当幼苗用0.05 mmol L^–1 Cd²⁺处理时, 根系中有10个蛋白质斑点, 叶片中有21个蛋白质斑点产生变化。利用MS/MS技术, 根系中有4个蛋白质斑点得以鉴别, 它们是ribosomal protein L 20 (斑点1)、F-box /LRR repeat protein (斑点2)、ribosomal protein small submit 4 (斑点4)和CBL-interacting protein kinase (斑点5)。在叶片中, 有2个蛋白质斑点消失, 4个蛋白质斑点合成, 它们是ABC transporter (斑点16)、maturase-like protein (斑点17)、chalcone synthase (斑点1)、a hypothetical protein (斑点3)、an unknown protein (斑点4)和a predicated protein (斑点6)。这些被鉴别的Cd²⁺反应蛋白参与生物合成、mRNA转录调控和蛋白质转运。