生物转化制备活性维生素 D3的研究进展

维生素D3本身没有生物活性,在体内需经羟化生成活性维生素 D3才能发挥其生理作用。目前主要通过化学合成法和微生物转化法来生产活性维生素 D3。化学合成过程复杂、污染严重,不适合工业化生产。而生物转化法条件温和,特异性强,反应步骤少,在制备活性维生素 D3中具有重要意义。综述了参与维生素 D3代谢的哺乳动物 CYP450羟化酶、维生素 D3羟化菌株及生产过程中采用的基因工程方法,并展望研究方向的发展趋势。     

稻瘟菌侵染诱导的水稻过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶的抗血清制备

 通过选择性抽提、盐析、阴阳离子交换柱层析等步骤从非亲和性稻瘟菌侵染的120g稻叶中获得了诱导性过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶(POG)的电泳纯蛋白250μg。利用这些纯化蛋白,制备了POG的抗血清。点免疫杂交结果表明,该抗血清效价大于1:5000,其抗原检测灵敏度可达0.05ng,并具有较好的特异性。蛋白印迹结果显示,稻瘟菌侵染可诱导POG在水稻细胞膜上的累积。     

大豆磷脂羟酰化的研究

对大豆磷脂羟酰化的研究，所得产品具有良好的乳化性、润湿性和乳化稳定性．结果表明，过氧化氢加入量对产品的质量和主要性质有显著影响，温度对碘值和过氧化值分别有一定的和显著影响，低压蒸汽的量对过氧化值有一定的影响，氢氧化钠加入量对乳化稳定性有一定的影响，并得出磷脂羟酰化的最佳工艺条件．     

构建番茄红素β/ε环化酶基因RNAi植物表达载体及其表达分析

根据GenBank中Lyc-β基因(X86452)及Lyc-ε基因(Y14387)设计引物,通过高保真PCR从番茄cDNA中克隆到两段长度为302和330bp的Lyc-β基因片段和两段长度为302和288bp的Lyc-ε基因片段。从质粒pCAMBIA-2301(AF234316)克隆出gusA基因长度为168和235bp的2个内含子片段。根据RNAi原理将正、反向序列与内含子连接,之后插入启动子与终止子之间构建成4组植物表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草植株,通过PCR鉴定共获得107株转基因植株。利用荧光定量PCR分析干扰效果,结果显示经4组干扰载体干扰后,转基因植株中目的基因mRNA含量分别为对照的3.4%、16.4%、15.2%和21.8%。进一步用HPLC对应分析转化株的番茄红素含量,结果表明转基因植株中番茄红素平均增长量分别为3.4、2.1、3.4和2.0μg/g。同时测定转基因植株中的β-胡萝卜素与叶黄素含量,发现它们根据干扰的基因不同呈现对应的变化。     

羊驼皮肤中可溶性鸟苷酸环化酶的表达差异

采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和Western blotting对可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)在棕色和白色羊驼皮肤中的表达差异进行了研究,以探讨sGC在羊驼皮肤中的作用。实时荧光定量PCR结果显示,sGC在棕色羊驼皮肤中的相对表达量较低,是其在白色羊驼皮肤中的表达量的0.16倍,且差异极显著(P<0.01);Western blot-ting结果显示,在羊驼皮肤总蛋白中含有与兔多克隆抗体发生免疫阳性反应的条带,在棕色皮肤中的反应阳性弱于白色皮肤,且差异极显著(P<0.01);免疫组织化学结果表明,sGC免疫阳性主要分布在白色羊驼皮肤毛囊的毛球上方细胞及细胞间质,而在棕色羊驼皮肤毛囊中,sGC免疫阳性主要分布在毛球底部和外根鞘细胞及细胞间质。结果提示sGC参与羊驼毛色形成。     

辣椒倍半萜植保素代谢的分子生态学研究

为建立克隆辣椒倍半萜环化酶基因的cDNA文库,我们尝试了用紫外线（UV）处理离体辣椒叶片,考察UV对辣椒倍半萜环化酶活性的影响,结果表明UV能诱导辣椒叶片表达倍半萜环化酶活性;不同抗性水平的辣椒品种倍半萜环化酶活性对紫外线的反应有差异,紫外线处理后,抗病品种cm334在24 h 出现酶活性高峰,而感病品种subiche在36～42 h出现酶活性高峰; 在紫外线处理后0～24 h cm334的酶活性高于subiche。UV对辣椒倍半萜环化酶活性的诱导作用与UV的作用方式、剂量及辣椒植株的生育期有关, 紫外线交联处理45 s诱导10叶期的倍半萜环化酶活性最高;5支15 W紫外灯相距20 cm照射15 min低于1支相同的紫外灯处理;在相同的UV作用下,开花前辣椒叶片倍半萜环化酶活性显著高于开花以后的辣椒叶片。另一方面,紫外线处理是辣椒叶片中的鲨烯合成酶活性受到一定程度的拟制。     

芹菜中类胡萝卜素合成相关番茄红素ε–环化酶基因AgLCYE的克隆与表达分析

番茄红素ε–环化酶（lycopene epsilon cyclase,LCYE）是类胡萝卜素合成途径中的关键酶。从‘津南实芹’中克隆获得番茄红素ε–环化酶基因AgLCYE。序列分析结果显示,AgLCYE包含1个1 590 bp的开放阅读框,编码529个氨基酸。氨基酸序列多重比对表明,芹菜和其他物种的LCYE同源性为77.68%,AgLCYE和同属伞形科的胡萝卜LCYE氨基酸序列同源性高达98.07%。AgLCYE蛋白与胡萝卜LCYE蛋白进化关系最近。AgLCYE蛋白属于亲水性蛋白,预测的蛋白质三级结构中有9个α螺旋和18个β折叠。无序化分析结果表明,AgLCYE编码的氨基酸序列有4个无序化区域。用UPLC方法对30、45和60 d龄芹菜叶中叶黄素和α–胡萝卜素的含量进行测定,30 d时叶黄素含量最高,45 d时最低,45和60 d时无显著性差异,叶片中的叶黄素含量均高于叶柄。芹菜叶片和叶柄中均没有检测到α–胡萝卜素的存在。荧光定量表达分析结果显示,随着生长期的增加,叶片中AgLCYE的相对表达量逐渐升高;叶柄中逐渐降低。     

人CYP27B1真核表达构建及其在293T细胞表达

CYP27B1是血清活性维生素D_3合成的关键酶,根据Gen Bank报道的序列设计特异引物,以Hep G2细胞的c DNA为模板,扩增CYP27B1的编码区,构建CYP27B1的真核表达载体,在293T细胞表达并检测其催化活性。结果表明,重组表达载体pc DNA-CYP27B1构建成功,pc DNA-CYP27B1及对照质粒pc DNA分别瞬时转染293T细胞。Western blot检测结果表明CYP27B1在293T成功表达。HPLC检测结果显示重组表达的CYP27B1能羟化25(OH)D_3生成1α,25(OH)_2D_3。     

番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

LYC-b基因反义表达对番茄果实番茄红素含量的影响

【目的】研究番茄红素β-环化酶(LYC-b)基因反义表达对番茄果实中番茄红素含量的影响,为番茄品质育种提供新方法。【方法】以番茄品种"TTI1117A"和"灵光3号"为材料,构建了分别由CaMV35S启动子驱动的GUS标记基因和反义LYC-b5′基因双价植物表达载体,通过农杆菌GV3101介导,将基因整合到番茄基因组中,采用GUS、PCR以及RT-PCR、Northern杂交进行检测,并测定了转基因植株果实中的番茄红素含量。【结果】由GUS、PCR检测结果可知,筛选出1株"TTI1117A"和4株"灵光3号"转基因植株;RT-PCR、Northern杂交检测结果表明,目的基因在RNA水平上已经表达;对番茄果实中番茄红素含量的测定结果表明,转基因植株果实中番茄红素含量均高于未转基因植株。【结论】LYC-b基因的反义表达具有提高番茄果实中番茄红素含量的作用。