芹菜中类胡萝卜素合成相关番茄红素ε–环化酶基因AgLCYE的克隆与表达分析

番茄红素ε–环化酶(lycopene epsilon cyclase,LCYE)是类胡萝卜素合成途径中的关键酶。从‘津南实芹’中克隆获得番茄红素ε–环化酶基因AgLCYE。序列分析结果显示,AgLCYE包含1个1 590bp的开放阅读框,编码529个氨基酸。氨基酸序列多重比对表明,芹菜和其他物种的LCYE同源性为77.68%,AgLCYE和同属伞形科的胡萝卜LCYE氨基酸序列同源性高达98.07%。AgLCYE蛋白与胡萝卜LCYE蛋白进化关系最近。AgLCYE蛋白属于亲水性蛋白,预测的蛋白质三级结构中有9个α螺旋和18个β折叠。无序化分析结果表明,AgLCYE编码的氨基酸序列有4个无序化区域。用UPLC方法对30、45和60 d龄芹菜叶中叶黄素和α–胡萝卜素的含量进行测定,30 d时叶黄素含量最高,45 d时最低,45和60 d时无显著性差异,叶片中的叶黄素含量均高于叶柄。芹菜叶片和叶柄中均没有检测到α–胡萝卜素的存在。荧光定量表达分析结果显示,随着生长期的增加,叶片中AgLCYE的相对表达量逐渐升高;叶柄中逐渐降低。     

胡萝卜中类胡萝卜素积累与主要合成基因转录水平相关性分析

以胡萝卜白色野生资源‘松滋野生’和欧洲橘色栽培品种‘Amsterdam’及其回交重组自交系（BILs）中的5个不同根色株系为试材,研究其根和叶中α–胡萝卜素、β–胡萝卜素合成途径分支点上LCYE、LCYB1、CHXE、CHXB1基因转录表达与类胡萝卜素含量之间的关系。cDNA测序结果表明,松滋野生和Amsterdam之间存在多个SNP变异位点。类胡萝卜素测定发现,Amsterdam叶中α–胡萝卜素含量（87.3 μg ? g-1）显著高于松滋野生（2.8 μg ? g-1）,而其β–胡萝卜素含量（122.7 μg ? g-1）显著低于松滋野生（237.9 μg ? g-1）。qRT-PCR结果显示,LCYE、LCYB1、CHXE和CHXB1在不同材料的根和叶中均表达,其中LCYE与根中α–胡萝卜素、β–胡萝卜素及总类胡萝卜素含量之间呈显著正相关;与叶中叶黄素和总类胡萝卜素含量之间呈显著负相关,说明LCYE对类胡萝卜素积累起着关键性作用。     

芜菁二氢黄酮醇4–还原酶基因的克隆与功能鉴定

二氢黄酮醇4–还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）是花青素生物合成晚期阶段的关键酶,属于NAD/NADP依赖型还原酶家族,催化从二氢黄酮醇转变成无色花色素苷的反应。利用UV-A处理‘津田’芜菁（‘Tsuda’turnip）和‘赤丸’芜菁（‘Yurugi Akamaru’turnip）块根24 h后提取总RNA,通过RT-PCR方法分别克隆了‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因。BrDFR1和BrDFR2的开放读码框分别为1 158 bp和999 bp,分别编码385和332个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrDFR1和BrDFR2与大白菜DFR具有高度同源性,从第8到第302位氨基酸的肽段具有FR_SDR_e结构域。BrDFR1和BrDFR2基因组全长序列均含有5个位置与序列完全相同的内含子。Southern杂交结果显示,‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因均为单一拷贝。UV-A可以诱导BrDFR1基因表达,对BrDFR2基因表达的诱导效果不明显。BrDFR1和BrDFR2基因在大肠杆菌细胞中可以表达并纯化出分子量约为42.8 kD的BrDFR1蛋白和37.5 kD的BrDFR2蛋白。过量表达BrDFR1和BrDFR2基因的烟草花色加深。芜菁DFR基因的RNAi载体遗传转化烟草后,转基因植株的花色变浅。这些工作将为阐明依光型和非依光型花青素生物合成机理奠定研究基础。     

芋淀粉分支酶SBE基因的克隆与表达分析

以多子芋品种‘香堂芋’幼嫩叶片为试材,利用RACE结合RT-PCR技术克隆得到全长为3 051 bp的淀粉分支酶SBE基因cDNA序列（登录号：KX013544）,其中开放阅读框长2 538 bp,编码845个氨基酸;该序列与玉米SBEII、马铃薯SBEIIa同源性均达85%以上;芋SBE编码蛋白具有N–末端、C–末端和α–淀粉酶催化域。利用RT-PCR技术克隆得到芋SBE的基因组DNA序列,全长为12 362 bp,包括20个外显子和19个内含子。芋球茎形成过程中,子芋植株叶片中SBE表达量显著高于母芋植株叶片、叶柄和根系及母芋等组织,子芋膨大过程中SBE表达量逐渐升高,而孙芋膨大过程中SBE表达量逐渐下降。子芋、孙芋SBE表达对支链淀粉合成积累可能起重要作用。     

欧李番茄红素β–环化酶基因ChLCYb的分离与功能鉴定

利用RACE技术和RT-PCR相结合,从欧李[Cerasus humilis(Bge)Sok]果实中克隆获得长度为1798 bp的番茄红素β–环化酶(lycopeneβ-cyclase)基因ChLCYb的cDNA全长序列,开放读码框为1515 bp,编码503个氨基酸。序列分析发现,ChLCYb具有植物LCYb保守区(Plant LCYb conserved region)、FAD/NAD(P)结合区(Dinucleotide-binding signature)、"Cyclase motif 1"、"Cyclase motif 2"和"lycopeneβ-cyclase motif"等典型结构特征,在N–端存在1~84个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在85~106、209~227、373~391和460~480氨基酸区域包含4个跨膜结构域。荧光定量PCR结果表明,ChLCYb在叶中表达量最高,其次是幼果,在根中最低;在欧李果实发育过程中,果皮中ChLCYb表达量高于果肉,果皮中ChLCYb表达量先升高,在花后90 d左右表达量最高,然后呈缓慢下降趋势,而果肉中ChLCYb表达量相对平稳。ChLCYb表达模式与果皮和果肉中β–胡萝卜素含量的积累呈显著正相关(r=0.824和r=0.712,P0.05)。利用大肠杆菌工程菌体系诱导表达了ChLCYb蛋白,并证实其可催化工程菌株中番茄红素向β–胡萝卜素转化,其转化效率达71.22%。在番茄中超量表达ChLCYb促进果实中番茄红素向β–胡萝卜素的转化和积累,转基因株系L-11号果实中的β–胡萝卜素含量高达692.18μg·g~(-1) DW,是非转基因对照的4.42倍。     

契斯曼尼番茄果实中可溶性固形物和β–胡萝卜素含量相关基因QTL 分析

 以野生番茄契斯曼尼LA0317与栽培番茄自交系9706为亲本，构建了包括152个株系的BC₂S₆群体。利用155个SSR标记、21个CAPS标记和88个Indel标记构建了契斯曼尼番茄的遗传连锁图谱，总图距1 134.0 cM，标记间平均距离4.29 cM。采用复合QTL区间作图法对番茄果实中的可溶性固形物含量和β–胡萝卜素含量进行QTL分析。定位到10个与可溶性固形物含量相关的QTLs，分别位于第3、4、5、6、9、10、11号染色体上，其中有5个QTL效应值在12%以上。定位到6个与β–胡萝卜素含量相关的QTLs,分别位于第1、2、6、9号染色体上。其中,位于6号染色体上的qBC6b效应值达到54.7%，为一主效QTL。此外，还获得了可用作育种材料的5个高可溶性固形物含量株系和8个高β–胡萝卜素含量的株系。     

超量表达欧李ChPSY基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究

将从欧李果实中分离的ChPSY cDNA经过序列分析、酶切之后,连接到植物表达载体PMV,构建了植物重组载体pBI-ChPSY,并通过根瘤农杆菌EHA105介导转化番茄,获得了12株抗性植株。PCR检测和Southern杂交结果显示,12株抗性植株均为阳性,说明外源基因ChPSY整合到转化植株的基因组中。RT-PCR分析表明,ChPSY基因在转化植株果实中得到表达。HPLC分析表明,转ChPSY基因番茄果实中总类胡萝卜素含量增加了1.62 ~ 3.04倍,八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素含量分别增加了4.87、2.10、2.59和3.25倍。转化植株中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影响。ChPSY基因超量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。     

香蕉茉莉酸合成关键酶基因MaOPR 的克隆和表达分析

 从‘巴西’香蕉（Musa acuminata L. AAA group‘Brazilian’）根的cDNA 文库中获得了一段 12–氧–植物二烯酸还原酶OPR（12-oxo-phytodienoic acid reductase）基因的片段,RACE 扩增获得全长, 命名为MaOPR。该基因全长1 512 bp,存在一个完整的开放阅读框1 287 bp,编码429 个氨基酸。生物 信息学分析表明,该蛋白属稳定蛋白,等电点为8.11,具有一个活性位点,一个基质结合位点,一个黄素 单核苷酸结合位点。序列预测分析该蛋白亚细胞定位为细胞质,其不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。通 过和已知植物的12–氧–植物二烯酸还原酶基因相比,同源性达到66%以上。其中与苜蓿、谷子、粳稻、 紫云英的OPR 编码的氨基酸序列的同源性均为71%。器官特异性分析表明,MaOPR 在香蕉的根、茎、 叶片、花和果实中均有所表达,其中在茎和果实中表达量较高。通过对其在ABA 抑制剂、乙烯、枯萎病 胁迫下的表达结果分析显示,该基因响应以上3 种胁迫。     

野生毛葡萄水通道蛋白基因VhPIPs的克隆与组织特异性表达研究

从野生毛葡萄组织中克隆了9个质膜水通道蛋白基因（VhPIP）的cDNA全长序列,并研究了其生物信息学特征及组织特异性表达。氨基酸序列分析表明,9个VhPIP分为PIP1和PIP2两类;均含有MIP蛋白家族保守的信号序列SGGHINPAVT和两个NPA（Asn-Pro-Ala）单元,均为稳定性蛋白、疏水性蛋白,且每个VhPIP均含有6个跨膜区。实时荧光定量RT-PCR分析表明,这9个VhPIP在抗旱的毛葡萄‘花溪–9’根、茎、叶中均有表达,其中VhPIP1;1、VhPIP1;2、VhPIP1;4、VhPIP2;1、VhPIP2;2和VhPIP2;4在其根中的表达量最多,可能与根部水分运输的调节密切相关;VhPIP1;5和VhPIP2;3在其叶中的表达量最多,可能主要参与叶片的水分运输,与叶片的蒸腾作用密切相关;VhPIP1;3在根、茎和叶中的表达量无显著性差异;相对于其他基因的表达,VhPIP1;1和VhPIP2;4在根中表达量最高,这两个基因可能在水分运输过程中起较大作用。     

石蒜黄烷酮3–羟化酶基因LrF3H 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR 和RACE 技术相结合的方法,从石蒜花瓣中克隆到1 个黄烷酮3–羟化酶（F3H） 基因的cDNA 全长序列,全长1 293 bp,包含1 098 bp 的完整开放阅读框,编码365 个氨基酸;氨基酸序 列比对显示该序列编码的氨基酸与水仙的F3H 具有高达91%的同源性,将其命名为LrF3H。二级结构预 测表明,随机卷曲是LrF3H 蛋白最大量的结构元件,而α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。保守结构 域预测表明该基因编码的蛋白具有典型的F3H 蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2–O–酮 戊二酸结合位点,属于2OG-FeⅡ_Oxy 双加氧酶超家族。实时荧光定量PCR 分析表明,LrF3H 在整个花 发育过程中均表达,而且从初蕾期到盛开期随着花瓣着色加深表达量逐渐增加,盛开期表达量最高,之 后随着花朵萎蔫表达量下降;在不同器官中,LrF3H 的表达量在花瓣和花葶中最高,而在根、鳞茎和叶 片中都很低,推测该基因在石蒜花色形成过程中起着关键作用。     

芹菜AgERF4转录因子基因的克隆与表达分析

以‘六合黄心芹’芹菜为材料,克隆出编码乙烯反应元件结合蛋白基因AgERF4。序列分析表明,AgERF4含有1个长度为597 bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,预测其蛋白质相对分子质量为21.43 kD,等电点为8.51。进化分析表明,ERF4转录因子在植物中高度保守。AgERF4属于亲水性蛋白。酵母单杂交和β–半乳糖苷酶活性测定结果确定AgERF4转录因子和乙烯应答元件GCC Box具有较高的结合活性。RT-qPCR分析表明,AgERF4在芹菜叶片中的表达水平较高,在根和叶柄中表达水平较低;高温和干旱条件下AgERF4的表达呈先上升后下降的趋势,在盐处理的24 h内AgERF4的表达始终高于对照。AgERF4转录因子在芹菜非生物逆境胁迫调控过程中起着重要作用。     

芹菜AgHAT4的克隆与表达模式分析

以两个芹菜品种‘六合黄心芹’和‘文图拉’为试验材料，分别克隆获得HAT4转录因子基因AgHAT4。应用生物信息学方法分别从氨基酸组成、蛋白结构与理化性质、以及系统进化树等方面对该基因进行分析。结果表明，AgHAT4含有1个长为900 bp的开放阅读框（ORF），编码299个氨基酸。‘六合黄心芹’和‘文图拉’中的AgHAT4基因有1个核苷酸位点的差异，编码的氨基酸有1个位点的差异，其蛋白质相对分子质量分别为33.71和33.68 kD，等电点均为9.12。进化树分析表明芹菜AgHAT4与胡萝卜的HAT4属于同一分支。蛋白结构预测显示，该蛋白主要由3个α螺旋和一些无规则卷曲构成，且未定位到信号肽。荧光定量PCR结果表明，AgHAT4在芹菜叶柄中的表达量最高，根中次之，叶片中表达量最低。多种非生物胁迫导致芹菜AgHAT4的表达量发生变化。与未胁迫对照相比，高温胁迫处理后‘六合黄心芹’中AgHAT4的表达量在24 h明显上调，在盐胁迫条件下‘文图拉’和‘六合黄心芹’中AgHAT4的表达有着相似的变化趋势，均先上升后下降且在处理2 h后表达量达到峰值。‘文图拉’中AgHAT4的表达量在高温处理4 h后表达量最高，而在低温条件下在处理2 h后表达量最高。     

胡萝卜根中主要类胡萝卜素含量相关QTL的精细定位

以白色的野生胡萝卜‘松滋野生’(Ws)和橘色的栽培胡萝卜品种‘Amsterdam’(Af)为亲本构建的回交重组自交系(BIL)为试材,基于低倍重测序技术开发SNP标记,构建了由1 976个Bin标记组成,包含29 435个SNP标记的遗传图谱。图谱总距离834.28 c M,平均图距0.42 c M。通过对胡萝卜肉质根中类胡萝卜素含量相关QTL分析,在连锁群LG04和LG08中检测到调控α–胡萝卜素、β–胡萝卜素、ζ–胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和总类胡萝卜素含量的主效QTL(M-QTL)2、2、3、2、2和2个,表型贡献率为11.47%~19.18%;另检测到调控α–胡萝卜素、β–胡萝卜素、ζ–胡萝卜素、玉米黄质和总类胡萝卜素含量的上位性QTL(E-QTL)1、1、2、1和1个,表型贡献率为2.50%~3.66%。在M-QTL显著区间内共检索到36个有功能注释的预测基因,其中Dck018297为ζ–胡萝卜素脱氢酶2基因,与调控β–胡萝卜素合成和总类胡萝卜素含量有关;Dck008006为乙烯响应因子2.2的同源基因,与调控α–胡萝卜素、ζ–胡萝卜素合成有关;Dck029898为转录因子b HLH135的同源基因,与调控玉米黄质合成有关。     

‘中油桃9号’及其黄肉突变体花和叶片中类胡萝卜素代谢及相关基因的时空表达

以‘中油桃9号’及其黄肉芽变的花和叶片为试材,采用HPLC法对类胡萝卜素的积累水平进行定性和定量分析,实时荧光定量PCR法对类胡萝卜素代谢关键基因的表达水平进行分析。结果表明:在花萼中,黄肉突变体的总类胡萝卜素水平为‘中油桃9号’的5.7倍,其中的β–胡萝卜素为‘中油桃9号’的19.6倍;除DXS和LCY-E外,突变体花萼中无论是合成类胡萝卜素的基因,还是降解类胡萝卜素基因的表达水平均显著高于‘中油桃9号’。在花瓣中,两个材料的类胡萝卜素总量无显著差异,但各类胡萝卜素成分含量存在显著差异;突变体DXS、HDR、PDS、LCY-E、CHY-B和CCD1的表达量显著高于‘中油桃9号’,ZDS、NCED1和CCD4的表达量显著低于‘中油桃9号’。在叶片中,‘中油桃9号’和黄肉突变体均以β–胡萝卜素、紫黄质、9–顺式–紫黄质和叶黄质为主,幼果期时两个材料的类胡萝卜素总量无显著差异,果实成熟后突变体的类胡萝卜素总量呈上升趋势,显著高于‘中油桃9号’;自花后55～80 d,仅CCD4的表达模式与类胡萝卜素的积累一致,因而认为CCD4的表达差异是两个材料后期叶片类胡萝卜素含量差异的主要原因。     

Changes in kale (Brassica oleracea L. var. acephala) carotenoid and chlorophyll pigment concentrations during leaf ontogeny

There has been recent market interest in “baby” salad greens. However, little information exists on the nutritional differences between immature “baby” greens and produce traditionally sold at the fully mature stage. Kale (Brassica oleracea L. var. acephala D.C.) contains high levels of lutein and β-carotene, which possess important human health properties. Kale was grown in a controlled environment and pigments were measured in young (<1 week), immature (1–2 weeks), mature (2–3 weeks), fully developed (3–4 weeks) and senescing (>4 weeks) leaves using high-performance liquid chromatography (HPLC). Significant differences were observed for all pigments during leaf development. Pigment accumulation followed a quadratic trend, with maximums occurring between the 1st and 3rd week of leaf age. The highest concentrations of lutein measured 15.1 mg/100 g fresh mass and occurred in 1–2 week old leaves. The remaining pigments reached maximum levels at 2–3 weeks (β-carotene at 11.6 mg/100 g; chlorophyll a at 251.4 mg/100 g; and chlorophyll b at 56.9 mg/100 g fresh mass). Mature fully expanded kale leaves accumulated higher carotenoid concentrations than immature or “baby” leaves, with senescent leaves having the lowest carotenoid concentrations. Harvesting kale leaves at a mature stage of development resulted in maximum carotenoid values. Cultural management practices that increase carotenoid concentrations would be expected to improve nutritional quality for fresh markets.     

鹤望兰ζ–胡萝卜素脱氢酶基因SrZDS的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰(Strelitzia reginae Banks)黄色花萼中克隆到1个ζ–胡萝卜素脱氢酶基因(Sr ZDS)。其c DNA全长2 111 bp(Gen Bank收录号:KT428724),具有完整的开放阅读框,共1 710个碱基。与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性,其中与玉米的ZDS同源性最高,达到86%。系统进化树分析显示,Sr ZDS与水仙蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明:Sr ZDS在鹤望兰黄色花萼中高表达,且在花发育的始花期和盛花期表达量最高。应用UPLC对其类胡萝卜素含量进行分析,其总量在黄色花萼中最高,且在盛花期最高,表明Sr ZDS的表达与类胡萝卜素含量成正相关。     

菠萝果肉颜色的形成与类胡萝卜素组分变化的关系

为了分析不同类型菠萝果实成熟过程中果肉类胡萝卜素成分的变化特点及其外观颜色差异形成的因素,以深黄色果肉的巴厘种和浅黄色果肉的卡因种菠萝为材料,应用高效液相色谱(HPLC)技术分析了菠萝果实不同发育阶段果肉类胡萝卜素成分及含量的变化。结果表明,随着果实的成熟,两菠萝品种果肉β-胡萝卜素、玉米黄质和β-阿朴-δ’-胡萝卜醛成分均呈上升趋势,尤其是β-胡萝卜素从青果期急剧增加到完熟期,而叶黄质却呈下降趋势。两品种的β-胡萝卜素含量都显著高于其他3种色素,而且在完熟期巴厘种的β-胡萝卜素含量是卡因种的2倍以上。因此,β-胡萝卜素是造成两品种菠萝果肉类胡萝卜素积累量及外观色泽差异的主要因素之一。     

‘中油桃9号’及其黄肉芽变的类胡萝卜素代谢和基因表达分析

以‘中油桃9号’（白肉）及其黄肉芽变的果肉为试材,采用HPLC法对类胡萝卜素的积累水平进行定性和定量分析,实时荧光定量PCR法对类胡萝卜素代谢关键基因的表达水平进行分析。结果表明：在幼果期,‘中油桃9号’与突变体的果肉颜色无明显差异,但在果实成熟时差别很大;幼果期时‘中油桃9号’与突变体的类胡萝卜素总量相近,以β–胡萝卜素、紫黄质和叶黄质为主;果实成熟期‘中油桃9号’的类胡萝卜素总量比突变体高很多,呈现出高含量的紫黄质、β–胡萝卜素和玉米黄质;实时定量表达分析表明,果实成熟期‘中油桃9号’的CCD4转录水平比突变体高得多。果实成熟时CCD4基因的表达差异可能是导致‘中油桃9号’与突变体类胡萝卜素积累差异的主要原因。