拮抗性木霉菌株抗逆性筛选评价标准与方法

本研究旨在为高效筛选耐受高温胁迫、低温胁迫、盐胁迫及干燥（干旱）胁迫拮抗性木霉菌株提供筛选阈值。根据5种、20株拮抗尖孢镰孢菌效果较好的木霉菌对上述逆境因子的反应差异，建立每种逆境因子在不同水平下的木霉菌株生长和酶活变化检测阈值和标准化评价方式；分析木霉菌在不同胁迫条件下发育相关生化因子与菌株生长变化之间的关系，及相应胁迫下的孢子萌发率与菌落直径之间的相关性。通过正态性检验获得供试木霉菌株生长响应胁迫的阈值为：1 mol/L NaCl（盐胁迫阈值），36℃（高温胁迫阈值），14℃（低温胁迫阈值），400 g/L PEG-6000（干旱胁迫阈值）。相应胁迫下的菌落直径与孢子萌发率明显正相关。菌株在大部分胁迫下的抗坏血酸过氧化物酶（APX）及过氧化氢酶（CAT）酶活与菌丝干重有明显的相关性。本研究为科学评价生物防治木霉菌资源的抗逆性提供了依据。     

棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶家族基因特性研究

本研究旨对棘孢木霉基因组20个天冬氨酸蛋白酶家族基因（Asp）特性进行分析。分别进行了进行了保守区及家族预测、氨基酸多序列比较及功能区预测、进化关系分析及其在不同培养条件下棘孢木霉中的差异表达分析。20个Asp均属Asp蛋白酶家族(PF00026),均为酸性(PI<7)。有18个Asps含有信号肽。多序列比对发现Asps含有两个特征性催化指纹“DTGS/A”和“DT/SGS/Y/T/A/N”,根据第二个“DTGT”、“DSGT”、“DTGA/N”和“DSGY/T/S”特征性催化指纹,将20个Asps分为4个分支。进一步在C-hungry胁迫下,10个Asps基因上调,Asp54.2上调最高为3222。在N-hungry胁迫下,8个Asps基因上调,Asp50.9上调最高为33100。山新杨（Tas-PdPap）叶粉诱导后,13个Asps基因上调,Asp50.9上调最高为21078。说明棘孢木霉促杨树生长及与病原菌拮抗过程中,Asp起了非常重要的作用     

棘孢木霉T4小分子疏水蛋白基因hyb2克隆及序列分析

为了深入研究生物防治菌棘孢木霉T4菌株小分子疏水蛋白hyb2的功能,基于已知小分子疏水蛋白基因hyb2部分cDNA序列设计引物,分别以棘孢木霉T4菌株菌丝体总mRNA和基因组DNA为模板,进行PCR扩增,克隆获得hyb2的全长cDNA和DNA序列,其GenBank接受号分别为JX014433和JX185070,cDNA序列编码区长度为321 bp,编码106个氨基酸。BlastP相似性分析表明该基因与深绿木霉的Tahyd5a (ABS59366)基因同源性最高为87%,SignalP信号肽分析表明N端第16和17个氨基酸中间有一个信号肽剪切位点(AFA||AP)。Pfam蛋白家族分析表明它属于hydrophobin_2 superfamily家族。将棘孢木霉T4菌株小分子疏水蛋白基因hyb2对深绿木霉ATCC74058基因组和绿色木霉Gv29-8基因组进行同源性搜索,在2个近缘种的基因组上分别获得9个和8个同源序列。其中,深绿木霉ATCC74058的hyb-a-7和绿色木霉Gv29-8的hyb-v-5疏水蛋白与棘孢木霉Hyb2相似性最高分别为87%和70%,2个序列分别位于深绿木霉ATCC74058染色体骨架5和绿色木霉Gv29-8染色体骨架22上。     

抗逆性木霉菌株的快速筛选方法

为了高效筛选耐受高温胁迫(36℃),低温胁迫(14℃),盐胁迫(1mol/L NaCl)的木霉菌株,采用12孔板结合菌落面积自动扫描仪,对8种(24株)木霉菌在上述逆境因子下的反应差异进行测定,构建逆境胁迫下优良菌株快速筛选和评价方法。通过相关分析表明,12孔板中菌落直径与相应菌株在9cm平板上的菌落直径呈正相关(P0.05);通过线性回归分析得到,平板上菌落直径(Y)和12孔板中菌落直径(X)的线性回归方程分别为:Y=3.353 X+0.564,(36℃);Y=3.980 X-0.166,(14℃);Y=3.537 X+0.422,(1mol/L NaCl)。与传统筛选方法相比,快速筛选方法可以有效提高筛选效率并减少耗材。本研究关于木霉菌多孔板高效筛选抗逆菌株的技术对于今后科学利用木霉菌资源提供了重要依据和方法。     

棘孢木霉活性代谢产物的初步分离及其抑菌与促生长功能

为探究棘孢木霉CBS 433.97(Trichoderma asperellum CBS 433.97)的活性代谢产物在促进植物生长与抑制病原菌等方面的功能,本研究初步分离了棘孢木霉代谢产物,并分析了其活性成分对尖孢镰刀菌MC-1和CS-5的抑菌效果,同时研究了棘孢木霉代谢产物中的活性成分对小麦的株高、根长和发芽率的影响。用不同的萃取剂萃取棘孢木霉发酵液中的活性成分,正丁醇萃取相获得的粗提物对MC-1与CS-5的抑菌效果最好。进一步对正丁醇萃取相获得的粗提物进行薄层层析,获得了4个组分TA_1,TA_2,TA_3和TA_4,4个组分对MC-1与CS-5均无明显抑制作用,但组分TA_3在浓度为1 g·L~(-1)时,对小麦生长具有明显的促进作用。由此可见,棘孢木霉CBS 433.97代谢产物中具有能够抑制病原菌的生长、促进植物生长发育的活性成分,具有较好的开发潜力。     

玉米矮化病株及其根际土壤内线虫的分离与分子鉴定

为探究玉米矮化病的病原,采用Ludox TM悬浮法对从吉林和辽宁采集的玉米矮化病株及其根际土壤和健康株根际土壤分离的线虫进行了鉴定和种群比较,并对矮化病株茎基组织PCR产物进行测序分析。结果表明:玉米健康株根际土壤分离出29属线虫,特有线虫是角咽线虫属Actinolaimus和木盾移线虫属Peltamigratus,矮化玉米病株根际土壤分离出28属线虫,特有线虫为锥线虫属Dolichorus,二者相同的线虫属有27个。矮化玉米病株根际土壤中植物线虫种类和数量明显比健康株根际土壤中高,线虫种群数量差异明显的主要是矮化线虫属Tylenchorhynchus、短体线虫属Pratylenchus和刺线虫属Belonolaimus,病株根际土壤中这3个属线虫总数约占病株土壤分离线虫总数的20.23%、11.27%和10.40%。玉米矮化病株茎基组织中短体线虫属和矮化线虫属数量占优势,2个属的线虫数量分别占测序总数的22%、14%(吉林长岭)和16%、20%(辽宁黑山)。表明玉米矮化病的发生与植物线虫相关,很可能是多种线虫共同引起的病害。