水稻颖花自然开放过程中茉莉酸(JA)生物合成的变化

外源茉莉酸(JA)及其甲酯(MeJA)对水稻、小麦、黑麦和高粱等禾本科植物颖花开放具有强烈的诱导效应，然而内源JA是否参与颖花开放的调控目前还缺乏充分的证据。本研究应用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)系统检测了粳稻武运粳7号和籼稻明恢63颖花自然开放过程中JA水平变化，并以实时定量反转录PCR (real-time RT-PCR)技术分析了武运粳7号颖花开放过程中JA生物合成途径关键基因表达变化。结果发现，水稻颖花JA水平的变化与开颖进程相一致。JA水平在上午颖花开颖前较平稳，开颖时急剧上升至峰值，闭颖后又下降。开颖时JA水平的峰值比开颖前1 h提高4~5倍。与JA水平变化相对应，催化JA生物合成途径关键步骤同工酶的编码基因OsDAD1-3、OsLOX-RCI1、OsAOS1、OsAOC和OsOPR7的表达在开颖时会有不同程度的上调，闭颖后又下调。同一稻穗上正在开放的颖花JA含量及上述JA生物合成途径基因的表达水平也比已开放和未开放的颖花高。颖花开放时JA水平及其生物合成基因表达的上升和闭颖后的下降有力地表明内源JA参与水稻颖花开放的调控。     

OsCPK12基因功能研究和互作蛋白筛选

通过反向遗传学研究方法,构建OsCPK12基因敲除和超表达突变体,用150 mmol/L的NaCl进行盐胁迫处理,结果显示:超表达株系无论株高、根长还是叶片状态都优于野生型,而基因敲除突变体相比于野生型株高明显矮化,根的发育形态差,叶片枯黄,证实OsCPK12对水稻耐盐有正调控作用。用real-time PCR对突变体株系的根、叶鞘、叶片多个部位的激素信号转导路径基因的表达量进行分析,结果显示:超表达株系的多个激素受体编码基因和下游调控基因表达量显著上调,说明OsCPK12参与激素的信号转导并影响水稻抗逆反应。为进一步研究OsCPK12的基因功能,通过在水稻原生质体中表达融合蛋白进行OsCPK12的亚细胞定位,确定OsCPK12定位于质膜。用酵母双杂交的方法在水稻中花11膜蛋白文库中筛选到2个水通道蛋白OsPIP1-1和OsPIP2-7,且酵母点对点验证为阳性,推测OsCPK12可能通过与OsPIP1-1和OsPIP2-7互作,调控水分子进出细胞,提高了水稻的耐盐性。     

水稻花青素合成调控转录因子 OsC1 和 OsPAC1的功能

从黑米品种黑帅中克隆水稻内源调控花青素合成的转录因子OsC1和OsPAC1,并导入到白米粳稻品种Chao 2-10和ZH11中超量表达,结果显示:在超量表达OsC1的Chao 2-10的抗性愈伤分化阶段、再生转基因植株的叶片、叶鞘、稃尖等部位观察到花青素的积累;其他转基因材料,如超量表达OsC1的ZH11、超量表达OsPAC1的Chao 2-10和ZH11均未观察到花青素的积累;利用高效液相色谱(HPLC)测定转基因水稻叶片中花青素含量,发现主要是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷2种花青素。对转基因材料中花青素生物合成相关基因的表达量进行分析发现,Chao 2-10和ZH11超量表达OsC1后,花青素代谢途径上的大部分结构基因上调表达;Chao 2-10中超量表达OsPAC1后,OsCHS、OsCHI、OsANS、OsUFGT上调表达,而OsF3 H、OsF3’H表达基本没变;ZH11中超量表达OsPAC1后,OsCHS、OsANS、OsUFGT上调表达,而OsCHI、OsF3 H、OsF3’H的表达基本不变。     

水稻糖基水解酶基因GH27启动子克隆及初步分析

通过生物信息学方法找到水稻中与拟南芥β-葡糖苷酶类基因同源的糖基水解酶基因GH27.Northern检测结果显示该基因在衰老晚期的叶片中高量表达.利用PCR技术克隆GH27基因的启动子(PGH27)序列,构建启动子PGH27与报告基因GUS融合基因的表达载体PGH27:GUS,并通过农杆菌介导法转化水稻品种中花11,GUS染色结果表明该启动子PGH27可以有效地驱动GUS基因在转基因愈伤组织和水稻植株老叶中表达.     

普通野生稻转育后代稻褐飞虱抗性基因的初步定位

通过BR96与白56构建F2群体,利用均匀分布于水稻全基因组的122对多态性引物标记分析F2群体的基因型,构建遗传连锁图谱,考查F2衍生的F3各家系的褐飞虱苗期抗性等级,检测水稻褐飞虱抗性数量性状位点(QTL)。结果显示:分别在第3、4和6号染色体上各扫描到一个抗褐飞虱QTL位点,QBph3位于第3染色体RM489-RM282之间,LOD值为5.1,解释表型变异率是3.8%;QBph4位于第4号染色体RM16605-RM16717之间,LOD值为28.7,解释表型变异率是29.4%;QBph6位于第6号染色体RM276-RM527之间,LOD值为2.7,解释表型变异率是7.1%;3个QTL的联合贡献率为40.3%。Qbph4可解释表型变异率最大,初步判断Qbph4可能是一个控制褐飞虱抗性的主效基因。     

1种简单快速高效的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法

基于Golden Gate载体构建过程,对CRISPR/Cas9双靶点敲除技术的载体构建系统进行了优化,建立了一种简单快速高效且无PCR扩增的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法。在本方法中,只需将设计好的2个靶点DNA小片段和1个外源片段用T4DNA连接酶构建到CRISPR/Cas9载体上即可。用本方法对10个已报道的水稻基因构建了20个双靶点CRISPR/Cas9载体,阳性率为100%,测序结果显示无突变。该载体系统非常适合大批量CRISPR/Cas9载体的构建,同时也为其他植物中构建双靶点CRISPR/Cas9载体提供借鉴。     

遥控跑车的遥控液压技术研究进展

在综述索道遥控跑车的遥控液压系统研究现状的基础上,针对其存在的问题,提出遥控跑车的遥控液压技术的研究对策,并展望其发展前景。     

在质体中表达EPSPS赋予烟草草甘膦抗性

在烟草质体中应用来源于玉米的复合型顺式表达元件驱动来源于Isoptericola variabilis的新型耐草甘膦EPSPS基因AroA_(I.va*)的表达,使其在叶片及非绿色组织中同时高效表达。对获得的同质化质体转化植株进行转录及蛋白水平分子检测,结果表明:AroA_(I.va*)基因在转基因植株叶片及根部组织中均得到有效表达;达到同质化的烟草转基因植株pLSZ3#2和pLSZ3#3的T_0代种子可耐受高于12 mmol/L(2 000 mg/L)的草甘膦处理,在温室中培养的转基因植株可耐受1 800 mg/L剂量的草甘膦喷施处理。野生型与转基因植株的正反交实验证实通过质体转化获得的草甘膦抗性转基因植株具有母性遗传的特点。     

新型抗广谱性除草剂草甘膦转基因油菜的创制及其鉴定

草甘膦是世界上应用最广泛的广谱性除草剂,目前我国还没有自主知识产权的抗草甘膦油菜品种。本研究利用农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化方法,将新型抗草甘膦基因I.variabilis EPSPS转入甘蓝型油菜品系J9707中,获得了126株阳性转化株,阳性率为97.0%。这些转化单株中的T-DNA插入以单拷贝为主(占44.8%)。通过反向PCR确定了EPS-2、EPS-6和EPS-7等油菜转化体中T-DNA插入位置,并设计转化体特异性引物对它们的T0~T3代材料进行检测,证明了它们的T-DNA在基因组水平上整合的稳定性。RNA和蛋白水平的表达分析证实,I.variabilis EPSPS转基因及其蛋白产物在各转化株系不同世代能够稳定表达。苗期进行不同剂量的除草剂喷施处理发现,EPS-1、EPS-2、EPS-5、EPS-6和EPS-7等株系可耐受4倍田间推荐使用剂量的草甘膦。本研究所创建的新型抗草甘膦油菜种质资源将为我国抗除草剂油菜品种培育奠定了重要基础。     

根癌农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的研究

本研究以潮霉素抗性基因为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的花魔芋(Amorphophalluskonjac)的遗传转化体系。同时探讨了魔芋愈伤组织的培养基、筛选剂和筛选时间等因素对转化效率的影响。通过筛选时间不同的两个转化试验,分别从300个花魔芋愈伤组织中得到了16个和18个具有潮霉素抗性的愈伤组织,其抗性愈伤率为5.33%和6.00%。获得的抗性愈伤组织进一步在分化培养基上进行分化,其分化效率分别为31.2%和22.2%。移栽后,分别得到了39株和36株成活植株。PCR检测表明分别有26株和21株再生花魔芋出现了800bp的特异性扩增带型,其阳性率分别为66.7%和58.3%。随机挑取20个PCR阳性植株的DNA进行斑点杂交检测,结果表明外源基因已经整合到花魔芋的基因组中。