辣椒疫霉漆酶基因Pclac3克隆表达

辣椒疫霉是一种侵染性植物病原,能引起多种茄科及葫芦科植物的病害。利用同源克隆法从辣椒疫霉基因组内克隆了漆酶基因Pclac3,该基因全长1 881个核苷酸,编码626个氨基酸,与已知的真菌漆酶基因具有较高的同源性,并且具备漆酶基因的保守区域。利用PCR将该基因克隆于pPIC9K载体,并转化于毕赤酵母GS115,经过1%甲醇诱导表达获得其异源表达产物。将表达产物进行SDS-PAGE检测,获得分子量大约为90 kDa的特异蛋白。利用ABTS法对Pclac3的表达产物粗酶液进行酶活性分析发现,其活性在第11天时最大,达到45 U/mL。这为研究辣椒疫霉漆酶基因家族及探索卵菌漆酶生物活性及其潜在的应用提供了理论依据。     

中药材景天三七DNA提取方法的比较分析

以景天三七药材为材料,分别采用改良CTAB法、SDS法、高盐低p H法对其DNA进行提取并检测,旨在建立一种适合中药材景天三七的DNA提取方法。结果表明,改良CTAB法提取的DNA浓度为290μg/m L,电泳条带最亮,无拖尾现象,在浓度和纯度方面均优于其他2种方法,并可用于ISSR-PCR扩增,改良CTAB法是中药材景天三七DNA提取的最佳方法。     

FocVel2基因对黄瓜枯萎病菌丝生长及毒力的影响

 由尖孢镰孢菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病是世界黄瓜生产上的一种毁灭性病害。本研究鉴定了尖孢镰孢菌黄瓜专化型丝绒蛋白的一个同源基因FocVel2,利用基因敲除和互补的方法研究该基因的功能。敲除突变体菌株ΔFocVel2出现明显的表型变化,包括菌落生长速率降低和产孢量降低,并且敲除突变株对黄瓜幼苗毒力明显减弱,回补突变体菌株能够恢复敲除突变体ΔFocVel2的所有缺陷。总之,研究结果发现丝绒蛋白基因FocVel2在菌体无性繁殖以及侵染过程中起到重要作用。     

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶甲基酯酶Pcpme3基因真核表达及功能研究

 【目的】对辣椒疫霉果胶甲基酯酶Pcpme3基因进行真核表达,制备其特异性抗血清,为用Western blot检测该基因在辣椒疫霉致病过程中的功能奠定基础。【方法】利用TR-PCR分离鉴定Pcpme3的成熟肽片段,克隆于pPIC9K载体。将获得的表达载体转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和免疫家兔制备特异性抗体。【结果】酵母转化子经MD、MM平板筛选和G418抗生素筛选与PCR鉴定,获得Mut+/His+表型高拷贝重组转化子,经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵上清液,检测出43 kD的特异蛋白。重组蛋白免疫家兔制备特异抗血清,Western blot检测该基因在游动孢子侵染辣椒叶片中的表达,随着病情加重,该基因的表达逐渐增强,从而证明该基因参与了病菌的侵染致病过程。【结论】利用真核表达获得的蛋白制成特异性抗体可以有效地检测Pcpme3在辣椒疫霉侵染寄主过程中的功能特性。     

山西运城温室番茄灰葡萄孢对啶酰菌胺的抗性

针对山西运城温室番茄灰葡萄孢对杀菌剂啶酰菌胺的抗性进行调查与分析,从温室番茄病果和病叶上利用单孢分离法获得灰葡萄孢菌株105个。通过菌丝生长速率法测定菌株的EC_(50)值,结果表明,灰葡萄孢对啶酰菌胺的EC_(50)值为0.40～132μg/mL,抗性菌株81个,占测试菌株总数的77.14%;敏感性菌株24个。选取对啶酰菌胺表现敏感、低抗、中抗和高抗的菌株各10个,并对其SdhA、SdhB、SdhC和SdhD基因序列比对分析,结果显示, 30个抗性菌株SdhB的272位组氨酸发生点突变,而SdhA、SdhC和SdhD基因无突变。适应性分析显示抗性菌株与敏感性菌株在菌丝生长、产孢量、孢子萌发及致病性方面都存在明显差异。     

番茄灰霉菌啶酰菌胺抗性菌株生理特性初探

[目的]对番茄灰霉病菌敏感菌株和抗啶酰菌胺菌株苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(PDD)的生理生化特性的测定,以及菌株适应度评价和致病性测定分析。[方法]经不同浓度啶酰菌胺处理后,分别测定了抗性与敏感性菌株0~24h内PAL和POD活性变化;同时在PDA上培养这2种菌株,并分析了的菌落大小、菌丝干重及产孢量;利用体外接种番茄果实分析致病性强弱。[结果]发现药剂处理后,2种类型菌株PAL和POD活性都有升高趋势,但是抗性突菌株PAL和POD活性上升幅度较敏感菌株高。其中,2种类型菌株的PAL活性均在1.5h达到峰值,而后呈下降趋势;其POD活性在药剂处理后一直呈现上升趋势,在24h达到最大值。适应度评估显示抗性菌株与敏感性菌株的在菌落大小、菌丝干重及产孢量方面无明显差异,体外接种实验也表明两者致病力没有明显差异。[结论]啶酰菌胺抗性菌株比敏感性菌株具有较高的POD及PAL活性,而两者菌落大小、菌丝干重、产孢量及致病性方面无明显差异。     

月季黑斑病病原菌鉴定及室内药剂初步筛选

为有效防控月季黑斑病,于2017年6—7月自运城学院花圃采集具有典型黑斑症状的月季病叶,分离纯化获得病原菌,利用形态学特征、分子生物学特征及致病性测定对其进行鉴定;同时室内测定5种常用药剂对该病原菌的防治效果,筛选能有效抑制该病原菌菌丝生长及孢子萌发的药剂。本试验共分离纯化得到12株菌株,其病原菌形态特征一致、rDNA-ITS、GPD、EF-1α基因扩增序列均相同。结合形态学特征观察以及rDNA-ITS、GPD、EF-1α基因联合构建的系统发育树将运城月季黑斑病病原菌鉴定为链格孢Alternaria alternata。在5种药剂中,50%咯菌腈和50%异菌脲各浓度对月季黑斑病病原菌的抑菌效果均较好,对菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率分别达到95.2%和96.6%以上;其次是70%代森锰锌,3个浓度的菌丝生长抑制率在84.1%～87.2%之间,3个浓度的孢子萌发抑制率均高于93.5%,其中600倍液的孢子萌发抑制率最高,达98.1%;80%多菌灵和12.5%腈菌唑对月季黑斑病病原菌的抑制效果最差,菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率分别低于42.4%和46.3%。毒力测定结果显示,50%咯菌腈毒力最强,抑制中浓度EC_(50)为25.8 mg/L;12.5%腈菌唑毒力较弱,EC_(50)为160.3 mg/L,其它3种药剂的EC_(50)介于30.4～60.7 mg/L之间。因此,50%咯菌腈可湿性粉剂和50%异菌脲悬浮剂可作为防治由链格孢引起的月季黑斑病的优选药剂。     

FocVel2基因对黄瓜枯萎病菌丝生长及毒力的影响

 由尖孢镰孢菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病是世界黄瓜生产上的一种毁灭性病害。本研究鉴定了尖孢镰孢菌黄瓜专化型丝绒蛋白的一个同源基因FocVel2,利用基因敲除和互补的方法研究该基因的功能。敲除突变体菌株ΔFocVel2出现明显的表型变化,包括菌落生长速率降低和产孢量降低,并且敲除突变株对黄瓜幼苗毒力明显减弱,回补突变体菌株能够恢复敲除突变体ΔFocVel2的所有缺陷。总之,研究结果发现丝绒蛋白基因FocVel2在菌体无性繁殖以及侵染过程中起到重要作用。     

放线菌LA-5主要抑菌成分及对灰葡萄孢的抑制作用

灰葡萄孢引起的灰霉病是葡萄采后重要病害之一。为筛选拮抗葡萄灰霉病的生防菌并明确其主要抑菌成分，本研究采用生长速率法分析了拮抗链霉菌LA-5发酵提取物的抑菌活性，测定了菌株LA-5发酵液提取物拮抗活性和稳定性，利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析了代谢产物的主要成分。结果表明，LA-5发酵提取物对灰葡萄孢具有明显的抑制作用，其对灰葡萄孢的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)分别为9和14 mg·L^-1。LA-5发酵液提取物耐高温、酸和紫外照射，对病原菌具有较稳定的拮抗活性。GC-MS分析结果显示，LA-5发酵液中的主要活性成分有17种，其中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)含量高达52.87%。DBP对灰葡萄孢菌丝生长及分生孢子萌发均具有强烈的抑制作用。本研究为灰霉病的生物防治提供了理论基础。