肉牛球虫病的临床诊疗研究

牛球虫病主要感染2岁以内的犊牛,严重影响犊牛的生长发育,甚至致其死亡,成年牛多为带虫者。河南省新乡市某肉牛场2个月前从吉林引进杂交肉牛30头,5 d前有1头牛发生不食、粪便带血,按出血性肠炎进行治疗,效果不好,之后又发病4头。经临床检查和实验室检查,确诊为肉牛球虫病,治疗后病情得到控制。1材料与方法1.1材料河南省新乡市某肉牛场6～8月龄的杂交肉牛30头。BK1000光学显微镜,50%甘油水,饱和食盐水。磺胺脒片,甲硝唑注射液等。1.2检查与治疗方法     

山羊乳腺上皮细胞的培养及EGFP基因转化

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物，并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现：纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构，呈乳头状，称之为乳球体；乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型，大多数上皮细胞呈短梭形或多角形，呈蜂窝状；部分细胞呈圆饼状，体积较大；部分细胞呈长形。采用电穿孔法将绿色荧光蛋白（EGFP）基因转化体外培养的山羊乳腺上皮细胞，荧光显微镜下观察到EGFP基因的表达。     

mailto:quan3145@163.com

 以小尾寒羊、同羊、内蒙细毛羊作受体，根据季节设计不同的同期发情处理方法，繁殖季节设计三个组，(Ⅰ)栓+PG组，(Ⅱ)栓组，(Ⅲ)PG组。非繁殖季节设计四个组(Ⅰ)栓+PG组，(Ⅱ)栓+PMSG组，(Ⅲ)栓组，(Ⅳ)PG+PMSG组。结果表明：(1)在繁殖季节，同一处理品种间同期发情率及受体利用率之间差异不显著。但非繁殖季节，同羊和内蒙细毛羊同期发情率和受体利用率很低。选用小尾寒羊作受体比较理想。(2)单独使用阴道海绵栓或与其它激素配合诱导母羊发情效果优于用PG组或PG+PMSG组，在非繁殖季节使用孕激素诱导     

羊乳腺上皮细胞的形态观察

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物,并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现:纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;部分细胞呈长形。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体。     

二甲基苯蒽诱导山羊乳腺上皮细胞体外转化研究

分别用5,10和15μg／mL二甲基苯蒽(DMBA)的完全培养液处理体外培养的山羊乳腺上皮细胞36, 24和12 h,再以25 ng／mL佛波酯(TPA)作用2周,研究DMBA和TPA对山羊乳腺上皮细胞的诱导转化作用,确定最佳诱导转化条件,探讨二甲基亚砜(DMSO)对细胞增殖的影响。结果表明,用含15μg／mL DMBA的完全培养液培养12 h,再用TPA连续作用4 d,几乎无山羊乳腺上皮细胞存活,10μg／mL DMBA培养24 h转化效果较差,5μg／mL DMBA培养36 h转化效果最佳;转化的山羊乳腺上皮细胞体积增大、核浓缩、生长排列紊乱、无规则并出现转化灶; DMSO对细胞生长有抑制作用．随培养时间延长抑制作用减弱。试验初步建立了乳腺上皮细胞的体外转化系统。     

奶牛性控胚胎体外生产的影响因素及控制措施

针对奶牛胚胎体外生产环节,对体外受精和培养等技术进行了研究,旨在建立奶牛性控胚胎体外生产技术体系。结果表明,卵母细胞外周卵丘细胞至少保持3层以上,在成熟基础液中添加10ng/ml的EGF,利于核质成熟;在精子获能液中添加咖啡因降低精子的存活时间;牛胚胎前3d用CR1aa BSA培养,再用SOFaa 5?S培养,获得高的囊胚发育率,并且添加50ng/mlIGF-I后胚胎的发育得到了很大的改善。利用性控精液进行体外受精,受精率有轻微下降,但对生产的胚胎发育质量无明显(P>0.05)影响,胚胎移植后受胎率为40%左右。     

牛早期胚胎PCR法性别鉴定条件的优化

对牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系及反应程序进行了优化。结果显示,选用双套引物和连续复合PCR方法,先用雄性特异性引物进行10个循环,然后再加入牛特异性引物进行22个循环,共32个循环,可实现两种基因片段的同时扩增,保证了PCR的准确性。胚胎移植结果显示该方法准确可靠。     

牛卵母细胞的去核与激活

比较了Ionomycin(离子霉素)和乙醇及其与其他物质的组合激活牛卵母细胞的效果,并研究了去核时间、细胞松弛素B、末期去核等对去核效率的影响。结果表明,配合使用6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)或放线菌酮(CHX)可显著提高Ionomycin或乙醇激活牛卵母细胞的效率,Ionomycin+6-DMAP激活的牛孤雌胚在8/16细胞之后的发育率明显高于乙醇+6-DMAP(或CHX)。牛卵母细胞的去核在成熟培养20h或之前进行效果较好,此时有较高比率的卵母细胞中第一极体与染色体位置靠近。牛卵母细胞在不含细胞松弛素B的操作液中可进行去核,但所得核移植胚胎的卵裂率明显下降,而对8/16细胞胚之后的发育没有明显影响。牛卵母细胞的末期去核率显著高于中期,二者核移植胚胎的早期发育率基本相同。     

由体外受精囊胚获得ICR小鼠ES细胞

收集鼠卵母细胞和精子，采用体外受精技术，获得早期胚胎。体外培养胚胎至囊胚，分离内细胞团，获得ICR小鼠的ES细胞。结果不但获得了来自体外受精囊胚的ICR小鼠ES细胞，而且表明用体外受精方法获得的小鼠早期胚胎的数量明显大于常规方法，且比较稳定。ICR小鼠ES细胞的获得，为研究小鼠的ES细胞分化提供了条件。     

牛胚胎移植产业化超数排卵的系统研究

为了提高供体牛的利用率,加速胚胎移植技术的产业化,试验系统地研究了超排方案、青年奶牛的月龄及发情周期不同阶段、重复超排次数、超排间隔时间、卵巢状态、胎次与产后间隔时间对超排效果的影响,共超排供体奶牛1 127头次,回收胚胎共10 900枚,可用胚胎数量为6 942枚,平均每头次获得胚胎数量为6.73枚.结果表明:①应用PSO1、PSO2和 PSO3三种方案进行超排处理,PSO3方案的超排成功率和平均回收可用胚胎数均高于其他两个方案;②利用发情周期9～11 d的自然发情奶牛直接超排效果最好;③对青年奶牛进行超排处理,应限制超排起始时间,15月龄以上的青年奶牛超排效果较好;④供体牛连续重复超排控制在3次以内,连续4次超排处理后极大降低胚胎可用率;⑤超排处理的间隔最短时间应该选择46～60 d;⑥经产牛1～3胎次超排效果较好,7胎次以上较差;⑦产后间隔时间选取80～90 d.