原核注射转基因猪的准备——诱发发情、超数排卵和原核胚的获取

进行了湖北白猪青年母猪的诱发发情、超数排卵和配种后注射hCG影响胚胎发育阶段的研究,比较了自然发情、诱发发情和超数排卵处理母猪的排卵数、冲卵数和胚胎的发育阶段。结果表明:PG诱发发情效果(51.3%)明显优于PMSG、hCG组合(0);超数排卵两种剂量组合间的差异显著;复配后注射hCG显著地提高了原核胚的数量;自然发情、诱发发情和超数排卵3个处理中,诱发发情组原核胚的数量显著高于其他两组。     

新城疫病毒HN基因片段原核表达重组质粒的构建

根据GenBank中发表的新城疫病毒F48E9基因序列设计引物,采用RT-PCR技术,成功获得了该病毒HN基因中两个不交叉的基因片段,长度分别为790bp和579bp.将这两段基因分别克隆到pGEM-T vector中,经酶切鉴定和测序后克隆到原核表达栽体pET-28a,PCR和酶切鉴定表明,克隆的两个新城疫病毒基因片段已经正确地插入到了原核表达载体pET-28a之中.     

猪羊生长激素基因保守性研究

生长激素基因在猪羊间的差异 ,通过两对引物 ,分别为P1:5’ -agctggattctttacggctgagcc - 3’和P2 :5’ -tccggaagcaggagagcagaccgtag - 3’ ,P3:5’ -gctgacacctacaaggagtttg - 3’和P4:5’ - gtttgcttgaggatctgtcctg - 3’。对它们的DNA进行聚合酶链反应 ,电泳及序列分析结果表明 :P1-P2和P3-P4引物都能扩增出猪羊DNA样 ,得到大小一致的扩增带 (对应引物的带 ) ,但southern杂交结果的差别很大 ;生长激素基因的碱基组成在猪羊间的差异为 6 5 % ,即猪羊生长激素基因保守性很强     

人类MCP和CD59双基因导入小鼠的整合及传代研究

将人类MCP(膜辅因子蛋白)和CD59(终末阶段同源限制因子)两种基因采用混合注射的方法,导入521枚昆明小鼠的受精卵原核中,得到原代转CD59基因小鼠14只,CD59的整合率为18.4%;转MCP基因小鼠12只,MCP的整合率为15.7%;转CD59 MCP双基因小鼠7只,双基因整合率为9.2%;转基因效率5%。通过5只存活的G0代转双基因小鼠和非转基因小鼠的繁殖,得到F1代转MCP小鼠14只,转CD59小鼠16只,转双基因小鼠10只;F1代双基因占33.3%。     

α-1,3-半乳糖苷转移酶基因沉默载体的构建

根据小鼠α-1,3-GT基因mRNA序列设计并合成了特异性的发夹状RNA干扰序列,以pCDNA3为基本骨架,选取人类H1启动子,构建了针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性基因沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础.     

湖北白猪IGF-I基因的克隆及序列分析

[目的]以湖北白猪肝脏作为试验材料,克隆出湖北白猪胰岛素生长因子（IGF-I）基因,并对其序列进行分析。[方法]采用Trizol法从湖北白猪的肝脏中提取总RNA,将其作为RT反应的模板,用P2（5＇-CAGGTAACTCGTGCAGAGCAAAGGA-3＇）引物合成IGF-I基因cDNA第一链,以其产物为模板,再以P1（5＇-CCCATCTCCCTGGATTTCTTTTTG-3＇）和P2为上下游引物扩增到大小约为607 bp的产物,并将其克隆至pCRII载体上,经蓝白斑筛选、酶切、测序。[结果]经筛选、酶切、序列分析,表明该片段为IGF-I基因的cDNA克隆,它由607个核苷酸组成,其中1～145位是5＇端非翻译区,从第146位ATG起始密码子开始至第538位TAG终止密码子5,39～607位是3＇端非翻译区,包含一完整的ORF,该ORF共有393核苷酸,编码一个推断由130个氨基酸组成的多肽。与GenBank中的序列比较,该序列与Muller等报道的猪IGF-I基因编码序列完全同源。[结论]成功克隆了湖北白猪IGF-I基因,并对其进行序列分析,证实了IGF-I基因的高度保守性,为采用转基因技术对湖北白猪进行育种奠定了基础和提供了技术依据。     

湖北白猪IGF-1基因的克隆及序列分析

[目的]以湖北白猪肝脏作为试验材料,克隆出湖北白猪胰岛素生长因子（IGF-1）基因,并对其序列进行分析。[方法]采用Trizol法从湖北白猪的肝脏中提取总RNA,将其作为RT反应的模板,用P2（5＇-CAGGTAACTCGTGCAGAGCAAAGGA-3＇）引物合成IGF-1基因cDNA第一链,以其产物为模板,再以P1（5＇-CCCATCTCCCTGGATTTCTTTTTG-3＇）和P2为上下游引物扩增到大小约为607bp的产物,并将其克隆至pCRII载体上,经蓝白斑筛选、酶切、测序。[结果]经筛选、酶切、序列分析,表明该片段为IGF-1基因的cDNA克隆,它由607个核苷酸组成,其中1～145位是5＇端非翻译区,从第146位ATG起始密码子开始至第538位TAG终止密码子,539～607位是3＇端非翻译区,包含一完整的ORF,该ORF共有393核苷酸,编码一个推断由130个氨基酸组成的多肽。与GenBank中的序列比较,该序列与Muller等报道的猪IGF-1基因编码序列完全同源。[结论]成功克隆了湖北白猪IGF-1基因,并对其进行序列分析,证实了IGF-1基因的高度保守性,为采用转基因技术对湖北白猪进行育种奠定了基础和提供了技术依据。     

体外生产猪原核期胚胎的初探

初步研究了在体外生产猪的原核期胚胎.结果表明:将在体外成熟培养44h的卵母细胞移植入发情当日的母猪体内,同时进行人工授精,受精后16 h冲出胚胎,获得同期原核期胚胎的效率最高,可以降低多精入卵的发生率.     

四环素诱导型单载体的构建、体外表达与鉴定

pTet-on-Advanced双载体表达系统应用于转基因动物研制,需要建立两种动物品系,经过杂交和筛选,才有可能得到转基因个体,操作繁琐,转化效率低。本研究在改良的四环素(Tet-on)基因可调控系统基础上,通过PCR的方法,分别从pTet-on-Advanced质粒和pEGFP-N1质粒中扩增rtTA和EGFP基因,测序正确后,将rtTA和EGFP基因亚克隆入pTRE-Tight载体中,构建四环素pTRE-Tight-rtTA-EGFP单载体表达系统,然后采用脂质体法,将新构建的单载体表达体系pTRE-Tight-rtTA-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞,以不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1和1g/L)强力霉素(Dox)诱导,通过荧光显微镜检测EGFP的表达量。结果显示,转染48h后,未加Dox无绿色荧光表达;1g/LDos诱导可以观察到绿色荧光;Dox浓度分别为0.0001、0.001、0.01和0.1g/L未观察到绿色荧光。表明1g/LDox才能激发调控作用。本研究成功构建pTRE-Tight-rtTA-EGFP新型可控性真核表达载体,该载体在细胞中的表达受Dox的调控,能正常发挥作用。研究结果为转基因的定量表达提供了新的技术平台,也为将构建的单载体用于表达可控的转基因动物研究提供了重要科学依据。     

猪乙脑快速诊断方法的建立与应用

根据乙脑病毒基因组3′末端保守区设计一对特异性引物,建立了乙脑病毒不同株的RT-PCR诊断技术.该技术可以从乙脑病毒WHe株、SA14-14-2株、P3株、SA14-14-2VS株接种的鼠脑组织中扩增出486bp的核酸片段,检出的灵敏度约为2pg.对20份临床样品的检测结果与小鼠脑内接种试验(MIT)的测定结果完全吻合,但RT-PCR诊断技术可在3h内直接对组织进行诊断,具有敏感、快速、稳定的优点.