绵羊MHC-DQB2 exon3单倍型的构建及其与布鲁氏菌病易感性相关性

为探究绵羊MHC-DQB2基因exon3单核苷酸多态性及其单倍型与布鲁氏菌病易感性的相关性,对145只哈萨克绵羊进行了布鲁氏菌虎红平板检测(RBPT),并通过PCR-SSCP试验选取不同基因型个体进行扩增测序,对测序结果进行统计分析。结果发现,在exon3 282 bp内共有22个单核苷酸多态性位点,其中140A/C/T/G位点、155T/C位点在病例和正常组间存在显著差异(P0.05);在22个单核苷酸多态位点中,有18个符合Hardy-Weinberg平衡定律,最终构建得到21个单倍型,其中有2个单倍型(Hap6、Hap9)在病例和正常组间存在显著差异(P0.05),一个单倍型(Hap4)存在极显著差异(P0.01)。由此表明,绵羊MHC-DQB2 exon3单核苷酸多态性与布鲁氏菌病存在显著相关性。     

哈萨克羊DRB1基因外显子3多态性及生物信息学分析

试验旨在研究白细胞表面抗原DRB1基因外显子3多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。运用混合DNA池结合PCR产物直接测序方法,对哈萨克羊DRB1基因外显子3进行多态性分析,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学分析软件对PCR扩增所获序列进行RNA二级结构及蛋白质的二级结构和抗原表位分析。结果表明,在282bp的外显子3序列中共检测到7个SNPs,分别为:T10C、C119T(Trp→Arg)、G215C(Gln→Glu)、A238G、T245G(Ser→Ala)、G256A、C259T,这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及各基因型间不存在显著性差异(P0.05);进一步分析发现,各突变位点均引起RNA二级结构和最小自由能的改变,各错义突变位点均未引起蛋白质二级结构和抗原表位的改变。由此得出,DRB1基因外显子3的7个SNPs位点(T10C、C119T、G215C、A238G、T245G、G256A和C259T)与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

绵羊DRB1基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

为了揭示布鲁氏菌病的致病机制并研制其新型分子疫苗,试验利用酿酒酵母展示系统展示绵羊白细胞表面抗原DRB1基因,构建DRB1基因外显子2的酵母表面展示库。参照GenBank中绵羊MHCⅡDRB1基因序列设计引物,以绵羊脾脏组织cDNA为模板,反转录扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到克隆载体pEASY-T1,命名为pEASY-T1-DRB1。双酶切连接到表面展示载体pYD1上,成功构建了表面展示重组质粒pYD1-DRB1。以pEASY-T1-DRB1为模板,将DRB1基因外显子2两端进行点突变,产生新的酶切位点,然后对外显子2设计特异性引物。对500个绵羊样本进行DNA池化,扩增DRB1基因外显子2序列,双酶切后连接到经相同酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRB1-TB上,构建酿酒酵母表面展示库。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,计算库容量。将其转化酿酒酵母EBY100感受态细胞,经半乳糖诱导,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测。结果显示,绵羊DRB1基因成功整合到酵母基因组中,酵母展示库的库容量在105个以上,DRB1基因库成功展示在酵母细胞表面。由此说明,该库可用于下一步布鲁氏菌抗原肽的筛选。     

石河子地区不同秋眠级紫花苜蓿生产性能和营养品质比较

试验旨在研究石河子地区不同秋眠级紫花苜蓿的营养品质和生产性能，以获得适宜当地种植的优良休眠型苜蓿品种。选择10个不同秋眠级紫花苜蓿品种为试验材料，测定紫花苜蓿初花期的营养品质、生产指标和越冬率，并进行综合评价。结果表明，以渝苜1号为代表的第一类群非秋眠型和极非秋眠型苜蓿的生产性能和营养品质均为优，但越冬能力较差，半秋眠型（新疆大叶、Victoria和Archer）苜蓿的越冬性较强且综合性能表现良好，秋眠型（肇东、新牧2号和骑士2）苜蓿的越冬能力强，但综合性能较差。研究表明，综合考虑当地气候及苜蓿多年生的特性，应优选综合性能较好且越冬能力较强的半秋眠苜蓿（新疆大叶、Victoria和Archer）进行种植。     

绵羊DRB1基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

为了揭示布鲁氏菌病的致病机制并研制其新型分子疫苗,试验利用酿酒酵母展示系统展示绵羊白细胞表面抗原DRB1基因,构建DRB1基因外显子2的酵母表面展示库。参照GenBank中绵羊MHC Ⅱ DRB1基因序列设计引物,以绵羊脾脏组织cDNA为模板,反转录扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到克隆载体pEASY-T1,命名为pEASY-T1-DRB1。双酶切连接到表面展示载体pYD1上,成功构建了表面展示重组质粒pYD1-DRB1。以pEASY-T1-DRB1为模板,将DRB1基因外显子2两端进行点突变,产生新的酶切位点,然后对外显子2设计特异性引物。对500个绵羊样本进行DNA池化,扩增DRB1基因外显子2序列,双酶切后连接到经相同酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRB1-TB上,构建酿酒酵母表面展示库。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,计算库容量。将其转化酿酒酵母EBY100感受态细胞,经半乳糖诱导,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测。结果显示,绵羊DRB1基因成功整合到酵母基因组中,酵母展示库的库容量在10⁵个以上,DRB1基因库成功展示在酵母细胞表面。由此说明,该库可用于下一步布鲁氏菌抗原肽的筛选。     

哈萨克羊DRB1基因外显子3多态性及生物信息学分析

试验旨在研究白细胞表面抗原DRB1基因外显子3多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。运用混合DNA池结合PCR产物直接测序方法,对哈萨克羊DRB1基因外显子3进行多态性分析,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学分析软件对PCR扩增所获序列进行RNA二级结构及蛋白质的二级结构和抗原表位分析。结果表明,在282 bp的外显子3序列中共检测到7个SNPs,分别为：T10C、C119T（Trp→Arg）、G215C（Gln→Glu）、A238G、T245G（Ser→Ala）、G256A、C259T,这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及各基因型间不存在显著性差异（P > 0.05）;进一步分析发现,各突变位点均引起RNA二级结构和最小自由能的改变,各错义突变位点均未引起蛋白质二级结构和抗原表位的改变。由此得出,DRB1基因外显子3的7个SNPs位点（T10C、C119T、G215C、A238G、T245G、G256A和C259T）与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

哈萨克羊DQB2基因外显子2多态性及遗传变异分析

试验旨在研究DQB2基因外显子2多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。通过PCR-SSCP技术对146只布鲁氏菌阴性哈萨克羊血液样本和28只布鲁氏菌阳性哈萨克羊血液样本中的白细胞表面抗原DQB2基因外显子2的多态性进行研究,挑取不同的等位基因进行克隆测序,经卡方检验分析每个SNP位点的基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,应用生物信息学软件分析与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性相关的不同等位基因的mRNA二级结构及蛋白质的二级结构、三级结构和抗原表位。结果发现,在270 bp的外显子2序列中共检测到33个SNPs,其中C9G、A180G位点的基因频率在病例组和对照组中的分布具有极显著性差异（P<0.01）,其基因型频率在病例组和对照组中存在显著差异（P<0.05）;A13T、C133G位点的基因频率在病例组和对照组中存在显著差异（P<0.05）;进一步分析发现,A180G突变位点的最小自由能最低,其mRNA二级结构最稳定;A13T和C133G 2个突变位点均引起mRNA二级结构及蛋白质二级结构、三级结构和抗原表位的改变。本试验结果表明DQB2基因外显子2多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性呈显著相关。     

IL-2对布鲁菌侵染小鼠巨噬细胞释放细胞因子及吞噬能力的调节作用

为研究白介素2(IL-2)对被布鲁菌M5株侵染的巨噬细胞(MΦ)所释放的细胞因子(TNF-α、IFN-γ和NO)及吞噬能力的调节作用,通过对M5侵染的MΦ添加不同剂量的IL-2,用ELISA试剂盒检测MΦ(侵染的和未侵染的)在不同时间点所释放的细胞因子TNF-α、IFN-γ和NO含量的变化;用CFU涂板法计算胞内活菌数,从而计算巨噬细胞的吞噬指数,以此来探讨IL-2对MΦ在被M5侵染后的免疫调节作用。结果表明,IL-2作用于被M5侵染的MΦ所释放的细胞因子(TNF-α、IFN-γ和NO)的含量与对照组相比有显著的提高(P0.05),且存在一定的含量和时间的依赖性;IL-2对巨噬细胞吞噬M5的能力在一定程度上有促进作用,随着IL-2含量的增加,胞内活菌数亦增加,存在浓度依赖性。通过试验结果可知,IL-2可以促进MΦ活化,促进MΦ分泌TNF-α、IFN-γ和NO,增强机体免疫应答,为临床应用IL-2研究及治疗布鲁菌病提供新的思路和理论依据。