绵羊DRB1基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

为了揭示布鲁氏菌病的致病机制并研制其新型分子疫苗,试验利用酿酒酵母展示系统展示绵羊白细胞表面抗原DRB1基因,构建DRB1基因外显子2的酵母表面展示库。参照GenBank中绵羊MHCⅡDRB1基因序列设计引物,以绵羊脾脏组织cDNA为模板,反转录扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到克隆载体pEASY-T1,命名为pEASY-T1-DRB1。双酶切连接到表面展示载体pYD1上,成功构建了表面展示重组质粒pYD1-DRB1。以pEASY-T1-DRB1为模板,将DRB1基因外显子2两端进行点突变,产生新的酶切位点,然后对外显子2设计特异性引物。对500个绵羊样本进行DNA池化,扩增DRB1基因外显子2序列,双酶切后连接到经相同酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRB1-TB上,构建酿酒酵母表面展示库。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,计算库容量。将其转化酿酒酵母EBY100感受态细胞,经半乳糖诱导,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测。结果显示,绵羊DRB1基因成功整合到酵母基因组中,酵母展示库的库容量在105个以上,DRB1基因库成功展示在酵母细胞表面。由此说明,该库可用于下一步布鲁氏菌抗原肽的筛选。