绵羊MHC-DQB2 exon3单倍型的构建及其与布鲁氏菌病易感性相关性

为探究绵羊MHC-DQB2基因exon3单核苷酸多态性及其单倍型与布鲁氏菌病易感性的相关性,对145只哈萨克绵羊进行了布鲁氏菌虎红平板检测(RBPT),并通过PCR-SSCP试验选取不同基因型个体进行扩增测序,对测序结果进行统计分析。结果发现,在exon3 282 bp内共有22个单核苷酸多态性位点,其中140A/C/T/G位点、155T/C位点在病例和正常组间存在显著差异(P0.05);在22个单核苷酸多态位点中,有18个符合Hardy-Weinberg平衡定律,最终构建得到21个单倍型,其中有2个单倍型(Hap6、Hap9)在病例和正常组间存在显著差异(P0.05),一个单倍型(Hap4)存在极显著差异(P0.01)。由此表明,绵羊MHC-DQB2 exon3单核苷酸多态性与布鲁氏菌病存在显著相关性。     

两种布鲁氏菌弱毒株侵染小鼠巨噬细胞过程的荧光表征及分析

通过对绿色荧光蛋白（GFP）布鲁氏菌弱菌株M5（GFP-M5）和S19（GFP-S19）侵染小鼠巨噬细胞（RAW264.7）及对其与胞内溶酶体、内质网、高尔基体初次结合所用时间进行测定,探讨分析两种布鲁氏菌弱毒株侵染小鼠巨噬细胞过程的荧光表征。将GFP-M5和GFP-S19分不同时间段分别侵染RAW264.7,利用激光共聚焦和流式细胞仪观察和检测。结果显示,GFP-M5和GFP-S19均构建成功。布鲁氏菌M5和S19及GFP-M5和GFP-S19侵染RAW264.7后胞内生存能力无明显差异。GFP-M5和GFP-S19侵染30 min后均已进入小鼠巨噬细胞,2 h分别到达溶酶体、内质网和高尔基体。而两种弱毒株在1、2、3、4 h与各细胞器结合率相近。流式细胞仪检测结果显示,GFP-M5和GFP-S19侵染RAW264.7的GFP⁺细胞含量无显著差异（P>0.05）。结果提示,两种弱毒株在侵染进入宿主细胞的初期及侵袭能力并没有明显差异。     

哈萨克羊DRB1基因外显子3多态性及生物信息学分析

试验旨在研究白细胞表面抗原DRB1基因外显子3多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。运用混合DNA池结合PCR产物直接测序方法,对哈萨克羊DRB1基因外显子3进行多态性分析,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学分析软件对PCR扩增所获序列进行RNA二级结构及蛋白质的二级结构和抗原表位分析。结果表明,在282bp的外显子3序列中共检测到7个SNPs,分别为:T10C、C119T(Trp→Arg)、G215C(Gln→Glu)、A238G、T245G(Ser→Ala)、G256A、C259T,这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及各基因型间不存在显著性差异(P0.05);进一步分析发现,各突变位点均引起RNA二级结构和最小自由能的改变,各错义突变位点均未引起蛋白质二级结构和抗原表位的改变。由此得出,DRB1基因外显子3的7个SNPs位点(T10C、C119T、G215C、A238G、T245G、G256A和C259T)与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

NO/ADMA在布鲁菌侵染小鼠机体过程中的响应特征

本试验旨在研究布鲁菌侵染小鼠过程中一氧化氮(NO)的作用,以及NO和非对称性二甲基精氨酸(ADMA)在此过程的相互作用关系。以布鲁菌标准疫苗株M5侵染小鼠,首先用小鼠的血清进行虎红平板凝集(RBPT)和试管凝集试验(SAT),再用Griess试剂法和ELISA法测定对照组和侵染组不同组织和血清中的NO和ADMA含量,对小鼠肝脏和脾脏的各个侵染时间段进行CFU计数观察。结果显示,用布鲁菌M5侵染小鼠后,RBPT和SAT在14d时检测到有阳性反应。侵染组和空白对照组NO总含量上变化不大,但侵染组血清中的NO含量随时间出现下降,而肝脾中NO含量随时间出现上升,其他各组织NO含量波动不明显。而ADMA的总趋势与NO相反。CFU计数结果显示,小鼠肝脾内布鲁菌的数量在14d时一直处于增长状态,28d时布鲁菌的数量下降,表明布鲁菌的分裂繁殖和机体NO的含量存在一定的关系。     

绵羊DRB1基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

为了揭示布鲁氏菌病的致病机制并研制其新型分子疫苗,试验利用酿酒酵母展示系统展示绵羊白细胞表面抗原DRB1基因,构建DRB1基因外显子2的酵母表面展示库。参照GenBank中绵羊MHCⅡDRB1基因序列设计引物,以绵羊脾脏组织cDNA为模板,反转录扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到克隆载体pEASY-T1,命名为pEASY-T1-DRB1。双酶切连接到表面展示载体pYD1上,成功构建了表面展示重组质粒pYD1-DRB1。以pEASY-T1-DRB1为模板,将DRB1基因外显子2两端进行点突变,产生新的酶切位点,然后对外显子2设计特异性引物。对500个绵羊样本进行DNA池化,扩增DRB1基因外显子2序列,双酶切后连接到经相同酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRB1-TB上,构建酿酒酵母表面展示库。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,计算库容量。将其转化酿酒酵母EBY100感受态细胞,经半乳糖诱导,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测。结果显示,绵羊DRB1基因成功整合到酵母基因组中,酵母展示库的库容量在105个以上,DRB1基因库成功展示在酵母细胞表面。由此说明,该库可用于下一步布鲁氏菌抗原肽的筛选。     

推行“九制”,抓实防控

桥湾乡幅员面积大、饲养分散、交通不便、文化素质低等问题常常给基层防疫工作带来诸多困难。我担任乡站长以来，在防控工作中推行“九制”，取得了一些意想不到的效果。在此，愿与同行分享与磋商。     

绵羊DRB1基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

为了揭示布鲁氏菌病的致病机制并研制其新型分子疫苗,试验利用酿酒酵母展示系统展示绵羊白细胞表面抗原DRB1基因,构建DRB1基因外显子2的酵母表面展示库。参照GenBank中绵羊MHC Ⅱ DRB1基因序列设计引物,以绵羊脾脏组织cDNA为模板,反转录扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到克隆载体pEASY-T1,命名为pEASY-T1-DRB1。双酶切连接到表面展示载体pYD1上,成功构建了表面展示重组质粒pYD1-DRB1。以pEASY-T1-DRB1为模板,将DRB1基因外显子2两端进行点突变,产生新的酶切位点,然后对外显子2设计特异性引物。对500个绵羊样本进行DNA池化,扩增DRB1基因外显子2序列,双酶切后连接到经相同酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRB1-TB上,构建酿酒酵母表面展示库。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,计算库容量。将其转化酿酒酵母EBY100感受态细胞,经半乳糖诱导,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测。结果显示,绵羊DRB1基因成功整合到酵母基因组中,酵母展示库的库容量在10⁵个以上,DRB1基因库成功展示在酵母细胞表面。由此说明,该库可用于下一步布鲁氏菌抗原肽的筛选。     

绵羊DRA基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

根据绵羊DRA基因序列和酿酒酵母表面展示载体pYD1上的多克隆位点设计特异性引物,从绵羊组织中提取总RNA并逆转录,利用PCR技术扩增得到DRA基因,克隆获得762 bp目的片段,并提交GenBank,登录号:KR422362。将该基因通过双酶切连接到表面展示载体pYD1 上,成功构建了酿酒酵母表面展示重组质粒pYD1-DRA。将DRA基因外显子2两端进行基因点突变,形成新的酶切位点,继而对外显子2设计特异性引物,对绵羊大样本进行DNA池化,并将外显子2扩增产物测序,分析其多态性获得多态位点。重组质粒双酶切得到246 bp具有多态性的外显子2,将其连接到经同样酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRA-TB上,成功构建了酿酒酵母表面展示库。将其转化用于表面展示的酿酒酵母EBY100感受态细胞中,得到酵母转化子,挑取酵母菌的单克隆通过PCR 扩增及序列测定证实了DRA基因库已成功整合到酿酒酵母基因组中。经半乳糖诱导后,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测得到DRA基因库已成功展示在酵母细胞表面。     

哈萨克羊DRB1基因外显子3多态性及生物信息学分析

试验旨在研究白细胞表面抗原DRB1基因外显子3多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。运用混合DNA池结合PCR产物直接测序方法,对哈萨克羊DRB1基因外显子3进行多态性分析,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学分析软件对PCR扩增所获序列进行RNA二级结构及蛋白质的二级结构和抗原表位分析。结果表明,在282 bp的外显子3序列中共检测到7个SNPs,分别为：T10C、C119T（Trp→Arg）、G215C（Gln→Glu）、A238G、T245G（Ser→Ala）、G256A、C259T,这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及各基因型间不存在显著性差异（P > 0.05）;进一步分析发现,各突变位点均引起RNA二级结构和最小自由能的改变,各错义突变位点均未引起蛋白质二级结构和抗原表位的改变。由此得出,DRB1基因外显子3的7个SNPs位点（T10C、C119T、G215C、A238G、T245G、G256A和C259T）与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

哈萨克羊DQB2基因外显子2多态性及遗传变异分析

试验旨在研究DQB2基因外显子2多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。通过PCR-SSCP技术对146只布鲁氏菌阴性哈萨克羊血液样本和28只布鲁氏菌阳性哈萨克羊血液样本中的白细胞表面抗原DQB2基因外显子2的多态性进行研究,挑取不同的等位基因进行克隆测序,经卡方检验分析每个SNP位点的基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,应用生物信息学软件分析与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性相关的不同等位基因的mRNA二级结构及蛋白质的二级结构、三级结构和抗原表位。结果发现,在270 bp的外显子2序列中共检测到33个SNPs,其中C9G、A180G位点的基因频率在病例组和对照组中的分布具有极显著性差异（P<0.01）,其基因型频率在病例组和对照组中存在显著差异（P<0.05）;A13T、C133G位点的基因频率在病例组和对照组中存在显著差异（P<0.05）;进一步分析发现,A180G突变位点的最小自由能最低,其mRNA二级结构最稳定;A13T和C133G 2个突变位点均引起mRNA二级结构及蛋白质二级结构、三级结构和抗原表位的改变。本试验结果表明DQB2基因外显子2多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性呈显著相关。