标记探针法用于microRNA的多重可视化检测

为了建立研究microRNA快速、灵敏、多重的可视化检测方法,试验采用创新的夹心ELISA方法,以链霉亲和素包被的微孔板为反应平台,根据检测靶标microRNA序列设计标记biotin的抓取探针CP和标记FAM的检测探针DP,抓取探针CP将靶标microRNA固定到微孔板上,优化其最佳孵育时间;标记FAM的检测探针DP与靶标microRNA结合并间接偶联于微孔板上,anti-FAM-HRP与检测探针DP标记的FAM结合,并对其最佳孵育时间进行优化;HRP催化底物TMB,使其发生显色反应,并通过显色反应与酶标仪对靶标microRNA的特异性、灵敏性进行研究。结果表明:CP孵育的最佳时间为2 h;anti-FAM-HRP的最佳孵育时间为2 h;特异性检测时,除靶标外,其他突变序列均显示阴性;灵敏性检测时,检测限为12.75 pmol/L。说明建立的检测方法特异性良好,灵敏度较高,可以同时进行多序列检测,且检测过程可以在6 h之内完成,具有良好的应用性。     

2株副溶血弧菌不同盐度下致病性和毒力基因差异分析

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是常见的食源性致病菌和海水养殖动物致病菌,目前已知的毒力基因有tlh、tdh、trh、T3SS、pirA、pirB、toxR/S、orf8等。盐度是影响细菌基因表达的关键生态因子之一,为进一步探求副溶血弧菌的致病机理,对2株分别分离自海水和淡水养殖发病凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中的副溶血弧菌在不同盐度下的生长速率、致病性进行检测,并用q-PCR方法对菌株毒力基因携带和表达情况进行定量研究。实验结果表明:海水菌株383生长速率快于淡水菌株V9,但菌株383在生长稳定期的细菌浓度明显低于菌株V9;菌株383对凡纳滨对虾的致病性明显高于菌株V9,前者的48 h半致死浓度(LD_(50))低于后者2个数量级;2株副溶血弧菌皆携带毒力基因tlh、T3SS1和pirA/B,但未检测到tdh、trh、T3SS2、toxR/S和orf8。部分毒力基因表达量检测结果显示,菌株383和菌株V9均为vcrD1表达量最高,其次是pirA,vopD1表达量最低;4个毒力基因不仅在2菌株间的表达量差别较大,而且盐度对同一菌株不同毒力基因表达的影响也是不同的。2株副溶血弧菌的毒力与pirA和vcrD1的表达量呈正相关性。研究结果为探究环境因素与副溶血弧菌致病力的关系提供了科学依据,同时也提示,淡水养殖凡纳滨对虾要防范副溶血弧菌输入的风险。     

鲆鲽类细菌性败血症的病原诊断及药物防控

<正>工厂化鲆鲽类养殖过程中容易暴发很多疾病,其中细菌性疾病发生率最高,尤以细菌性败血症危害最大。细菌性败血症可以由多种细菌感染引起,主要症状表现为:体色发黑,上下颌、口腔、鳃、鳍基充血出血;解剖可见病鱼肝发黄、脾呈紫黑色等。细菌性败血症对养殖鲆鲽类的危害严重,经常给养殖户带来巨大的经济损失。在江苏赣榆鲆鲽类工厂化养殖池内发现有细菌性败血     

镉对绿鳍马面鲀幼鱼急性毒性、肝脏抗氧化能力及组织结构的影响

本研究采用静水生物测试法测定了镉(Cd2+)对绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)幼鱼的急性毒性。根据预实验结果,设定8.19、9.18、10.30、11.56 mg/L共4个Cd2+浓度梯度进行急性毒性实验,根据急性毒性实验结果,设定1.84、2.76、3.68和4.60 mg/L 4个不同浓度Cd2+急性暴露实验,分别在6、12、24、48、72和96 h检测肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽抗氧化酶(GSH-PX)活性及丙二醛(MDA)含量,观察肝脏、鳃组织结构的变化。结果显示,随着Cd2+浓度的增加,急性毒性效应逐渐增强,24、48、72和96 h半致死浓度 (LC50)分别为11.47、10.82、9.84和9.19 mg/L,Cd2+对绿鳍马面鲀幼鱼的96 h安全浓度为0.92 mg/L。6 h时,各浓度组SOD和CAT活性与对照组相比显著升高;6—48 h时,SOD、CAT、GSH-PX活性均呈先上升后下降的趋势;48—96 h时,各浓度组酶活性均呈下降趋势,且时间越长,浓度越大,活性越低。与对照组相比,MDA含量整体呈先降低后增加的趋势,12—48 h时,1.84和2.76 mg/L组MDA含量有波动,3.68、4.60 mg/L组MDA含量与时间和浓度成正比。24 h时,1.84 mg/L组肝脏组织未见明显变化,2.76、3.68和4.60 mg/L组肝脏组织开始受到明显损伤,表现为细胞体积增大且形状不规则,细胞膜边界模糊,1.84和2.76 mg/L组鳃组织相比无显著变化,3.68和4.60 mg/L组出现鳃小片弯曲,上皮细胞水肿膨大,相邻鳃小片相互黏连融合,无游离端,细胞坏死脱落等损伤现象。在安全浓度为0.92 mg/L内绿鳍马面鲀幼鱼可健康生长,SOD、CAT和GSH-PX活性变化及MDA含量反映了绿鳍马面鲀幼鱼受损害程度,可作为安全性风险评价的参考依据。     

8种染色方法对组织切片中虾肝肠胞虫染色效果的比较

病理检测是一种诊断病原及观察机体组织病理变化的重要方法,特殊染色是在病变组织中寻找病原体的前提手段,良好的染色有助于将病原体与组织区别,从而增加病原在组织切片中的检出率。为筛选出一种适用于虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)病理切片检测的最佳染色方法,使用苏木精-伊红(HE)染色法、Masson染色法、爱显蓝-雪夫(AB-PAS)染色法、甲苯胺蓝(TB)染色法、伟郝夫范吉森(EVG)染色法、劳克坚牢蓝(LFB)染色法、天狼猩红(Sirius red)染色和普鲁士蓝(PB)等8种染色方法对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)感染了虾肝肠胞虫的肝胰腺进行组织病理切片染色,并结合对EHP检出率的统计分析,比较了这些染色方法的优缺点。结果表明:HE染色法、AB-PAS染色法、TB染色法、EVG染色法、天狼猩红Sirius red染色法和PB染色法对孢子的染色效果较差,与背景颜色对比不明显,单个视野检出率较低; LFB染色法虽然使孢子易被识别,但是有孢子丢失现象,且组织染色效果差; Masson染色结果显示孢子呈现品红色,与组织颜色对比鲜明,孢子颗粒清晰可见,对组织细胞结构染色效果较好,且检出率也最高。综合分析染色效果及检出率,Masson染色法是一种非常适用于组织内的虾肝肠胞虫孢子染色的方法,本研究为微孢子虫病的组织病理研究提供一种有效的基础手段。     

七彩神仙鱼在循环水工厂化养殖模式下的水质变化情况

本研究构建了一种简单的七彩神仙鱼循环水养殖系统,记录并分析了养殖60 d内水质的变化情况。统计数据表明,氨氮刚入新池时呈现先升后降的趋势,最高数值可达0.92 mg/L,随后慢慢降低至零,因倒池出现波动,随后趋于稳定,保持在0.1 mg/L以下;亚硝酸盐的开始数值为0,随着氨氮指标降低而逐渐升高至1.132 mg/L,而后开始缓慢下降,数值同样会因倒池出现波动,但最终趋于零值;总体pH值变化范围是7.8～8.3,为适用于鱼体生长的的弱碱性水质;同时,日摄食量的变化趋势也反应出七彩神仙鱼在此循环养殖系统中生长较好。     

七彩神仙鱼肠炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

为确定七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)肠炎的致病菌并筛选敏感药物,利用传统培养法,从该鱼的肠道组织中分离出优势菌,通过生理生化试验及16S r DNA序列测序比对确定菌种信息,并使用药敏纸片法筛选致病菌的敏感药物。试验结果表明:优势菌株QC3为肠型点状气单胞菌(Aeromonas punctata),是七彩神仙鱼肠炎的致病菌株,此菌对氟苯尼考、强力霉素、庆大霉素、诺氟沙星高度敏感,对链霉素中度敏感,对土霉素、红霉素、青霉素、头孢唑林、氨苄西林表现出耐药性。根据研究结果,建议使用氟苯尼考、诺氟沙星、强力霉素、庆大霉素等药物对七彩神仙鱼肠炎病进行治疗。     

绿鳍马面鲀烂嘴症致病菌的分离鉴定及药敏试验

为确定绿鳍马面鲀烂嘴症的致病菌及筛选敏感药物,通过平皿划线法将患病组织内的细菌进行分离纯化,得到1株优势菌,命名为QZG3。该菌株在硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)弧菌选择性培养基上为绿色、圆形、黏稠状菌落,经革兰氏染色判断为革兰氏阴性菌；对该菌株的16S rRNA基因进行测序、鉴定,并经系统进化树分析,发现该菌株与阿尔法克弧菌(Vibrio alfacsensis)聚为1支,因此判断该菌株为阿尔法克弧菌。人工回感试验表明,该菌株为绿鳍马面鲀烂嘴症的致病菌；药敏试验结果显示,该菌株仅对氟苯尼考、恩诺沙星两种抗生素高度敏感,对土霉素、青霉素、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、四环素以及红霉素均表现出耐药性。因此建议养殖生产上选用氟苯尼考和恩诺沙星进行药物防治。