坏死梭杆菌白细胞毒素bsbse-gas-sh真核表达载体的构建

根据GeneBank中提供的白细胞毒素基因序列,设计引物并扩增bsbse和gas-sh片段。通过T4 DNA Ligase连接形成融合片段bsbse-gas-sh,亚克隆pMD○R18-T质粒和测序。成功构建表达bsbse-gas-sh毕赤酵母表达载体pPIC9K-bsbse-gas-sh。为下一步bsbse-gas-sh的真核表达及免疫机理研究奠定了基础。     

坏死梭杆菌外膜蛋白基因的克隆与表达

依据GenBank中登录的坏死梭杆菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因序列,设计1对引物进行PCR扩增OMP片段并克隆至pET-28a中,构建原核表达重组质粒pET-28a-OMP。将pET-28a-OMP转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,表达含2个His的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量为93 ku,为包涵体表达,具有反应原性。本试验结果为坏死梭杆菌OMP免疫机制的研究提供了基础数据。     

影响坏死梭杆菌分泌白细胞毒素因素的研究

利用已分离坏死梭杆菌菌株,建立坏死梭杆菌白细胞毒素活性体外检测方法,并评价培养条件对坏死梭杆菌天然白细胞毒素活性的影响。结果表明,预还原、厌氧无菌心脑浸液肉汤培养基(pH7.3左右)、培养时间10h～12h(对数生长期后期),此工艺参数下获取的细菌培养物上清液的白细胞毒性最大。获得的坏死梭杆菌天然白细胞毒素经Western blot证实,能被抗白细胞毒素重组BSBSE蛋白的兔血清识别,表明提取的白细胞毒素具有反应原性。     

坏死梭杆菌斑马鱼模型建立与LD50的测定

建立斑马鱼人工感染坏死梭杆菌动物模型。牛源坏死梭杆菌FN(AB)株以3×1010cfu/mL、3×109cfu/mL、3×108cfu/mL、3×107cfu/mL不同菌量,腹腔接种斑马鱼,定时观察斑马鱼的发病和死亡情况,建立动物感染模型。FN(AB)对斑马鱼的半数致死量(LD50)为1.06×106cfu/尾;感染发病鱼呈现出侧游、腹水、注射部位出血红肿等症状,肝脏、肾脏、肠道出现明显的病理学变化。斑马鱼可作为坏死梭杆菌致病性研究的动物模型。