PRRSV浙江株ORF5基因的原核表达与免疫原性分析

根据GenBank中公布的PRRSV基因序列(EU709837),设计一对PCR引物,以浙江分离株为模板,通过RT-PCR扩增出ORF5基因全序列.以PCR技术构建了缺失信号肽及三处跨膜区的重组ORF5基因,命名为g-ORF5.将g-ORF5基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中,转化入E.coli菌株BL21.经酶切和测序鉴定后,阳性菌株用1 mol/L IPTG诱导表达,用Ni-NTA纯化表达的重组蛋白.结果表明,重组GP5蛋白在大肠杆菌中获得表达.纯化后经ELISA和Dot-ELISA分析,表达蛋白具有免疫反应性,能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应.     

猪腹泻大肠杆菌LTa(R210G)和LTb原核表达及其在小鼠的免疫反应

大肠杆菌不耐热性肠毒素(LT)具有免疫增强作用,是良好的免疫佐剂.为了更好的研究其免疫增强效果,本研究将LT的两个亚基LTa(R210G)和LTb克隆到pGST中,原核表达ETa(R210G)和LTb,经Western-blotting分析,表达蛋白具有免疫原性.对表达蛋白进行大量纯化后,以卵清蛋白为模式蛋白(OVA)为模式蛋白,免疫小鼠,ELISA结果表明,OVA+LTa(R210G)佐剂组小鼠的抗体滴度最高,OVA+LTb和OVA+LTa+LT组抗体滴度相似,高于OVA+氢氧化铝组,而OVA+氢氧化铝组高于无佐剂OVA组.因此,LTa(R210G)和LTb具有良好的免疫增强作用,是一种极有希望的免疫佐剂.     

2011～2013年北京地区主要猪病流行情况和免疫效果分析

通过对2011～2013年北京地区主要猪病流行情况和疫苗抗体效价水平的分析,了解北京地区主要猪病的免疫情况如下:猪瘟免疫情况参差不齐,总体免疫水平不高;高致病性蓝耳病抗体效价水平合格率较高,部分猪场已停用疫苗展净化工作;口蹄疫抗体效价水平较好,也无临床发病病例。根据以上分析,笔者展望2014年猪病情况并提出了防治建议。     

北京规模化猪场病毒性腹泻隐性感染情况调查

为了解PEDV、TGEV和RV在猪群中的隐性感染情况,对北京市8个规模化养猪场开展流行病学调查.本次调查共采集到440份临床健康粪样,利用多重FQ-RT-PCR的方法进行检测,结果表明:PEDV、RV、TGEV的阳性率分明为14.1%、13.6%和3.2%;不同阶段的猪群中,PEDV在保育-育肥阶段阳性率最高,达到25.4%;RV在仔猪阶段阳性率最高,达到27.3%;TGEV在保育-育肥阶段阳性率为8.5%.由此可知,规模化猪场PEDV、TGEV和RV隐性感染情况较为严重.     

比较两种ELISA试剂盒在猪伪狂犬病血清抗体检测中的一致性

比较两种ELISA试剂盒检测结果的一致性,为流行病学调查和临床诊断筛选适合的商品化试剂盒。采用来自两个厂家的野毒抗体(gE)和免疫抗体(gB)ELISA检测试剂盒分别检测362份和392份猪血清,应用Kappa检验比较试验数据的一致性。结果显示:两种猪伪狂犬病抗体(g E)检测试剂盒联合检测出95份抗体阳性和256份阴性,符合率97.24%,结果一致性为极强(Kappa值0.932);两种猪伪狂犬病抗体(gB)检测试剂盒联合检测出351份抗体阳性和9份阴性,符合率91.84%,一致性为弱(Kappa值0.347)。以上结果说明,两种猪伪狂犬病抗体(gE)检测试剂盒都适用于PRV gE抗体检测,而两种猪伪狂犬病抗体(gB)检测试剂金差异较大,需慎重选择。     

TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用

根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒Ⅳ基因序列,设计了一对特异性引物和探针,扩增长度为186bp的片段。以克隆Ⅳ基因的质粒作为阳性标准品,建立了一种快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法在10^9-10^1copies／μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10copies／μL的质粒DNA,以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板时,均检测不到荧光信号,而重复性实验中其变异系数均小于2％,表明此方法具有很好的特异性和重复性。应用此方法对采集的60份,陆床样品进行检测,其阳性检出率为92％,而用常规RT-PCR方法进行检测,阳性检出率仅为80％。表明荧光定量RT-PCR方法的敏感性明显高于常规PcR检测方法。     

猪大肠杆菌LT基因位点突变、真核表达及小鼠免疫效果

大肠杆菌不耐热性肠毒素具有免疫增强的作用,为了更好的研究LT免疫增强效果,我们从临床分离大肠杆菌,提取基因组DNA,扩增出大肠杆菌不耐热性肠毒素基因LT,经位点突变,将LT210位的A突变为G,突变后的LT克隆到真核表达载体pCI质粒中,命名为pCI-LT(R210G),磷酸钙共沉法转染IBRS细胞证实LT(R210G)体外获得表达。将pCI-LT(R210G)免疫小鼠,ELISA结果表明:免疫小鼠两周后体内检测到特异性抗LT抗体,4周达到最高值。同时,MTT试验结果表明免疫小鼠产生强烈的淋巴细胞增殖反应。研究结果证明已成功构建pCI-LT(R210G)真核表达质粒,是一种极有发展前景的基因疫苗。     

pCI-LT(R210G)基因疫苗的免疫原性研究

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是由产肠毒素大肠杆菌(ETEC)分泌的一种外毒素,能够引起仔猪黄痢、白痢和猪的水肿病,是导致幼畜腹泻的直接致病因子致使规模化猪场中猪的发病率和死亡率都极高,严重影响了养猪场的发展和经济效益.     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA聚合酶和Mg2+浓度、退火温度(Tm)等PCR反应条件的优化,最终确定该双重RT-PCR的最佳条件为TaqDNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,Mg2+浓度为0.05 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Tm为51℃。特异性和敏感性检测结果显示,所建立的检测方法具有很好的特异性以及较高的敏感性。     

全域旅游视野下健康养生旅游发展对策

近年来,随着生活水平的提高和生活观念的转变,人们越来越热衷于行走这一类健康养生的旅游项目。调查发现,人们选择步行旅行这种旅游方式的主要原因在于出去散心,在放松自我的过程中感受大自然的美好,从客观的角度来说,这也是健康养生旅游产业发展起来的主要原因。分析了健康养生旅游发展的必然性,提出了健康养生旅游在全域旅游视野之下的发展途径。