猪基因组AFLP指纹图谱的构建

摘要：对猪（Sus scrofa）基因组AFLP指纹图谱构建的各项条件进行了优化,包括双酶切消化、接头连接、预扩增和选择性扩增、凝胶电泳银染技术及荧光标记检测法等,建立了稳定的猪基因组DNA的AFLP指纹图谱构建方法,采用E32/T32引物组合在45个猪种基因组混合DNA中检测到28个多态标记。     

应用四元回归分析估测黄牛活重

根据蒙城本地黄牛、秦本F1代、西本F1代(秦:秦川牛;西:西门塔尔牛;本:蒙城本地黄牛)及豫北黄牛、本夏利F2代和本夏西F2代(本:豫北黄牛;夏:夏洛来牛;西:西门塔尔牛)的体尺体重资料,运用生物统计方法对黄牛活重进行了四元回归分析,并建立了黄牛活重估测的四元回归方程。     

全基因组关联分析鉴别白色杜洛克×二花脸F2资源家系中猪阴囊疝易感基因位点的鉴定

【目的】通过基于单倍型的病例-对照全基因组关联分析(GWAS)鉴别白色杜洛克×二花脸F2资源家系中影响猪阴囊疝的易感位点及位置功能候选基因,并在远缘纯种猪阴囊疝三联体核心家系（Trio）群体中进行重复验证。【方法】利用Illumina porcine 60K SNP芯片对1 020头白色杜洛克×二花脸F2资源家系阴囊疝群体(包含19个阴囊疝患病个体)进行扫描获取基因型。通过Plink v1.07软件对基因型数据进行质量控制;剔除个体基因型检出率< 90%的个体,剔除SNP位点检出率< 90%、哈迪温伯格平衡卡方检验P≤10-3和最小等位基因频率< 0.05及性染色体上和无法定位的SNP位点。质控合格的SNP位点用PHASEBOOK构建出F2资源家系中每个个体的单倍型,并采用隐马尔可夫模型将其归类到数目预先定义的祖先单倍型中。使用基于广义线性混合模型的GLASCOW软件进行利用祖先单倍型的病例-对照全基因组关联分析。采用保守的Bonferroni校正方法得到基因组显著水平和染色体显著水平的阈值。对F2资源家系中达到染色体显著水平的易感SNP位点在包含237个患病个体的远缘纯种猪阴囊疝三联体核心家系(Trio)群体中进行同样的质控,并利用Haploview软件对质控合格的SNP位点分别展开基于单点和基于单倍型的传递不平衡分析(TDT),进行重复验证。【结果】白色杜洛克×二花脸F2资源家系中全部个体的38 033个SNP标记通过质控。在GWAS分析中,共发现108个达染色体显著水平(P<2.63×10-5)的猪阴囊疝关联SNP位点,分别位于染色体2、8和17上,最强相关的SNP位点位于17号染色体上。在远缘三联体核心家系群中,724个个体的96个SNP位点通过质控。对质控合格的SNP位点进行基于单点的TDT分析,结果发现5个显著相关的SNP位点得到重复验证(P<0.05),其中2号染色体上有1个SNP位点和17号染色体上有4个SNP位点,分别位于IQGAP2,CHMP4B,SERINC3,ZNF334 等4个基因内或其上下游。基于单倍型的TDT验证分析发现两个易感单倍型框,其中与基于单点TDT验证分析有重合的仅有SSC17上CHMP4B内及下游的两个易感位点。结合疝气发生机制及TDT分析结果,推测IQGAP2和CHMP4B可能是影响猪阴囊疝发生的两个重要的位置功能候选基因。【结论】本研究利用基于小样本的GWAS分析和较大样本群验证分析,在SSC2和SSC17上分别鉴别1个和4个阴囊疝易感位点,在SSC17上鉴别到两个易感单倍型。易感位点附近的2个基因IQGAP2和CHMP4B可能是影响猪阴囊疝发生的位置功能候选基因,值得进一步研究。     

凡纳滨对虾抗WSSV选育家系的建立及其抗病特性

2002-2007年在人工感染白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的基础上进行一代个体选育(G1)后,对凡纳滨对虾连续进行4代家系选育,共建立120个抗WSSV家系,感染实验结果显示,G2～G5选育家系对虾平均成活率分别为5.57％ ±9.83％,8.66％±11.52％,9.52％ ±8.84％和13.79％±12.86％;G2～G5选育家系对虾平均成活率的变异系数分别为1.77、1.40、0.97和0.87.根据每个家系对虾的成活情况每个世代可分为敏感、中等抗性和高抗性家系,G2～G5敏感家系在各代选育家系中的比例逐年下降,分别占76.5％、55.2％、51.4％和33.3％,抗病成活率分别为0.44％±1.09％、0.78％±1.70％、2.27％±2.76％和2.44％±3.09％,感染WSSV后2～3d出现1个急性死亡高峰;中等抗病家系在各代选育家系中的比例逐年上升,分别占0、20.7％、31.1％和38.5％,抗病成活率分别为0、9.08％±1.46％、10.7％±1.41％和11.36％ ±3.30％,感染WSSV后出现2个死亡高峰,第1死亡高峰值大于第2高峰;高抗家系在各代选育家系中的比例逐年上升(G4除外),分别占23.5％、24.1％、17.1％和28.2％,抗病成活率分别为22.23％±5.21％、22.70％±12.30％、24.45％ ±6.56％和28.98％ ±8.09％,感染WSSV后出现2个死亡高峰,第1死亡高峰值小于第2高峰.经连续的定向选育,对虾抗病性状一代比一代强,表现出明显的抗病性能,特别是高抗对虾不仅死亡率低且其死亡高峰推迟2～3d,延缓了对虾WSSV暴发的时间,但是每代每尾对虾平均产卵量逐年下降.     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗WSSV选育家系的建立及其抗病特性

2002-2007年在人工感染白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的基础上进行一代个体选育（G1）后,对凡纳滨对虾连续进行了4代家系选育,共建立120个抗WSSV家系,感染实验结果表明：G2~G5选育家系对虾平均成活率分别为5.57%±9.83%, 8.66%±11.52%, 9.52%±8.84% 和 13.79%±12.86%;G2~ G5选育家系对虾平均成活率的变异系数分别为1.77、1.40、0.97和0.87。根据每个家系对虾的成活情况可分为敏感、中等抗性和高抗性家系,G2至G5敏感家系在各代选育家系中的比例逐年下降,分别占76.5%、55.2%、51.4%和33.3%,抗病成活率分别为0.44%±1.09%、0.78%±1.70%、2.27%±2.76%和2.44%±3.09%,感染WSSV后2~3 d出现1个急性死亡高峰;中等抗病家系在各代选育家系中的比例逐年上升,分别占0、20.7%、31.1%和38.5%,抗病成活率分别为0、9.08%±1.46%、10.7%±1.41%和11.36%±3.30%,感染WSSV后出现2个死亡高峰,第1死亡高峰值大于第2高峰;高抗家系在各代选育家系中的比例逐年上升（G4除外）,分别占23.5%、24.1%、17.1%和28.2%,抗病成活率分别为22.23%±5.21%、22.7%±12.30%、24.45%±6.56%和28.98%±8.09%,感染WSSV后出现2个死亡高峰,第1死亡高峰至小于第2高峰。经连续的定向选育,选育对虾抗病性状一代比一代强,表现出明显的抗病性能,特别是高抗对虾不仅死亡率低且其死亡高峰推迟2～3d,延缓了对虾WSSV暴发的时间,但是每代每尾对虾平均产卵量逐年下降（P<0.05）。     

江西地方鸡种的AFLP多态性及其群体遗传关系

摘要：利用15对AFLP引物组合,检测了8个地方鸡种(南城黑鸡、余干五黑鸡、崇仁麻鸡、宁都三黄鸡、万载康乐黄鸡、广丰白耳黄鸡、东乡绿壳蛋鸡和泰和丝羽乌骨鸡)、1个培育品种（景德黄鸡）和1个外来鸡种（以色列隐性白羽鸡）池DNA的遗传变异,计算了10个鸡种的遗传相似系数,其中南城黑鸡与余干五黑鸡的遗传相似系数最高（0.7790）,其次为广丰白耳黄鸡与景德黄鸡（0.6726）,崇仁麻鸡和以色列隐性白羽鸡的遗传相似系数最低（0.2801）。在UPGMA聚类关系图中,8个江西地方鸡种及培育鸡种景德黄鸡聚成一大类,其中余干五黑鸡与南城黑鸡、广丰白耳黄鸡与景德黄鸡分别两两相聚,以色列隐性白羽鸡另聚成一类。实验结果表明,江西省地方鸡种和引进品种之间的亲缘关系较远;南城黑鸡和余干五黑鸡的遗传距离最近,两者有着极密切的亲缘关系。结合生产性能、体形外貌及此前RAPD研究结果,认为南城黑鸡和余干五黑鸡可能是“同种异名”。广丰白耳黄鸡和景德黄鸡也表现出较密切的亲缘关系,这与RAPD分析结果及广丰白耳黄鸡是景德黄鸡的原始亲本之一的育种历史相一致。     

巴马香猪周身皮肤厚度的测量及其与7号染色体候选SNPs位点的关联分析

【目的】测定中国地方小型猪品种巴马香猪成年时周身9个典型部位的皮肤厚度,揭示巴马香猪不同部位皮肤厚度变化规律,进行9个部位皮肤厚度与候选SNPs位点的关联分析,在巴马香猪群体中验证影响皮肤厚度的7号染色体主效QTL,为进一步在巴马香猪群体中大规模开展皮肤厚度等形态变化的分子遗传控制机理及其相关基因功能研究奠定基础,从而增强人们对猪皮肤的认知。【方法】从一个由319头300日龄巴马香猪组成的成年屠宰群体中,随机选取50头,包括27头母猪和23头阉割公猪,分别取头脸、肩、背、肷、臀、胸、下腹、腋下和管等9个部位的皮肤,利用电子游标卡尺对这些不同部位皮肤厚度进行精确测量,利用R语言基本统计包进行不同部位和不同性别间皮肤厚度的差异分析以及不同部位间皮肤厚度的相关分析。在猪7号染色体34.5-36.2Mb的区域选取46个SNPs位点,利用MassARRAY时间飞行质谱技术进行基因分型,结合上述测定的皮厚表型,利用广义混合线性模型及R语言SNPassoc软件包进行目标候选区域的关联分析。根据关联分析结果和基因的生物学功能确定可能的位置候选基因。【结果】(1)单因素方差分析表明巴马香猪9个部位的皮肤厚度存在极显著差异(P=2.95×10~(-117)),肷部和背部的皮肤最厚,分别为(5.15±0.92)和(4.97±0.85)mm,下腹和腋下的皮肤最薄,分别为(1.77±0.36)和(1.97±0.68)mm。皮肤厚度从厚到薄依次是肷部、背部、肩部、头脸、臀部、管部、胸部、腋下和下腹。(2)阉割公猪腋下皮肤厚度显著小于母猪的(P=0.021),其它部位皮肤厚度在母猪和阉割公猪间差异均不显著。(3)除了下腹皮肤厚度与背部、肩部、头脸部的不相关(P0.05)外,巴马香猪不同部位两两之间皮肤厚度均呈现不同程度地显著或极显著正相关。(4)关联分析结果表明,9个不同部位的皮肤厚度表型均与候选区域的某些SNPs存在极显著的关联,从强到弱依次是肷部、肩部、背部、腋下、臀部、胸部、头脸、管部和下腹。从而,证实了巴马香猪群体存在影响猪皮肤厚度的7号染色体主效QTL。(5)3个与皮肤厚度关联性最强的SNPs值得进一步关注,分别位于7号染色体的34856565、35543837和35573869位置。肷部的皮肤厚度与SNP(chr7:34856565)的关联显著性最强(P_(cor)=5.15×10~(-6)),这个SNP也是肩部皮肤厚度最关联(P_(cor)=5.75×10~(-6))的位点。SNP(chr7:35543837)是腋下(P_(cor)=3.05×10~(-5))、臀部(P_(cor)=0.010)、胸部(P_(cor)=0.013)和头脸(P_(cor)=0.025)皮肤厚度的最关联位点,也是肩部皮肤厚度的次最关联位点。SNP(chr7:35573869)则是背部皮肤厚度的最关联位点(P_(cor)=1.17×10~(-5)),SNPs(chr7:35543837和chr7:34856565)次之。(6)根据最强关联SNPs所在基因及基因生物学功能,初步推测ANKS1A和HMGA1基因可能是影响皮肤厚度的候选因果基因。【结论】较全面地测量了中国小型地方猪品种巴马香猪周身皮肤厚度,揭示了巴马香猪皮肤厚度在不同部位之间的变化规律。在巴马香猪群体中验证了影响皮肤厚度的7号染色体主效QTL位点,肷部、背部和肩部皮肤厚度表型性状与候选SNPs位点关联性更强,可能适合下一步大规模深入分析。ANKS1A和HMGA1基因可能是影响皮肤厚度的候选因果基因,但需要进一步生物学功能试验证明。     

鸡原生殖细胞(PGCs)的提纯及其超低温保存

利用密度梯度离心从孵化51～56h的鸡胚血液中提纯PGCs,通过形态鉴别和过碘酸－希夫试剂染色方法判定提纯的PGCs的纯度在80％左右。将提取到的PGCs放入到含有10％二甲基亚砜的TCM－199中,在液氮中进行保存。将超低温冷冻保存了1个月、6个月和12个月的PGCs（各3管）分别复苏后,用台盼蓝染色,通过红细胞计数板计数鉴定冷冻保存了不同时间的PGCs的平均存活率分别为91．7％、92．6％和91．9％。结果表明所采用的冷冻保存的方法是可行的。所采用的超低温冷冻保存方法简单易行,为今后以PGCs为目的细胞进行超低温冷冻,而后制作种系嵌合体进行保种的研究提供有利的实践基础。     

47个亚、欧、美洲野生、地方和培育猪群的AFLP多态性及群体遗传关系研究

采用双色荧光标记技术,检测21个中国地方猪类群、19个欧美商业猪类群、5个亚欧美野猪类群、1个中国培育猪种、1个杜洛克&#215;中国野猪杂种群体总共47个类群基因组DNA池的AFLP多态性,22种引物组合产生312个AFLP多态标记。根据多态标记信息,计算47个类群间的遗传相似系数,并构建UPMGA聚类关系图。结果表明,中国地方猪、中国野猪与欧美商业猪群、欧美野猪间存在明显的遗传分化,提示中国地方猪起源于亚洲野猪,而欧美商业猪种由欧美野猪驯化而来。杜洛克猪、长白猪和大白猪不同类群间的遗传相似性较高,但也存在一定的遗传分化。南昌白猪与大白猪、PIC L95系与太湖猪有着很近的亲缘关系,真实反映了其育成历史。嘉兴黑猪与梅山猪、冠朝猪、藤田花猪、上犹花猪和万安花猪等地方猪群遗传关系的研究结果与其形态学、地理分布和现行分类情况相一致,认为AFLP技术是遗传多样性和群体遗传学研究的一项有效的技术手段。     

仔猪断奶前腹泻抗病基因育种技术的创建及应用

产肠毒素大肠杆菌（ETEC）F4ac造成的断奶前仔猪腹泻病是养猪生产中的常见病,给世界养猪业造成了巨大经济损失。本研究面对这一现状,通过全基因组连锁定位分析、目的区域的重组断点事件分析和远缘群体高通量SNP标记的关联性分析等严谨的遗传学分析手段,确定了决定仔猪ETECF4ac腹泻易感性的基因为MUCl3基因,并发现了能准确鉴别易感个体和抗性个体的分子标记（准确率〉97％）,相关研究论文已分别发表于相关国际专业学术期刊,由此首次在国际上创建了离精准度的断奶前仔猪腹泻抗病育种新技术,并利用所创建的分子育种新技术进行大面积推广应用,实现了我国种猪遗传改良研究的重要自主创新。