影响克隆牛生产效率之因素研究

为了提高牛体细胞克隆的效率,比较了不同融合电压对核移植胚发育的影响,其中1.7kv/cm电场强度,获得了较高的融合率、卵裂率和囊胚率,分别为67.14%,76.59%和29.16%。比较了血清饥饿处理体细胞对核移植效率的影响,血清饥饿处理体细胞后,融合率、卵裂率和囊胚率分别为68.91%,74.79%和28.26%,与非血清饥饿处理的相比没有明显差异(分别为60.96%,71.91%和20.31%,P>0.05)。而且胚胎移植后的怀孕率和产犊率也没有差异(分别为29.17%,8.33%和33.33%,16.66%,P>0.05)。另外,通过加强克隆牛的产后护理,可以提高克隆牛的成活率。总之,优化生产克隆牛的各环节因素,可以从整体上提高克隆牛的生产效率。     

AREG对绵羊卵丘细胞葡萄糖代谢的影响

为研究双调蛋白(AREG)对绵羊卵丘细胞(Cumulus cells,CCs)葡萄糖代谢的影响,采集来源于中腔卵泡和小腔卵泡的卵丘-卵母细胞复合体(COCs),利用荧光定量PCR检测中、小腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢相关基因表达;添加AREG进行卵丘细胞的体外培养和卵母细胞的体外成熟(IVM),检测卵丘细胞的增殖,测定培养液或细胞中的葡萄糖、乳酸、NADPH和ATP含量。结果表明:1)来源于小腔卵泡的卵丘细胞G6PDH、PFKL和PFKM的mRNA表达量以及细胞增殖能力显著低于中腔卵泡卵丘细胞(P<0.05);2)较低浓度(10 ng/mL)的AREG显著提高了中腔卵泡卵丘细胞的增殖能力(P<0.05)而对小腔卵泡卵丘细胞无影响(P>0.05),在生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)的协同作用下,10 ng/mL AREG可以显著提高两者的增殖能力(P<0.05)且两者间差异不显著(P>0.05);3)在GDF9和BMP15的协同作用下,AREG可显著提高不同直径腔卵泡卵丘细胞培养液中的葡萄糖消耗、乳酸生成、NADPH生成以及细胞中的ATP含量(P<0.05);4)小腔卵泡卵母细胞的IVM培养液中添加AREG+GDF9+BMP15,显著提高培养液中的葡萄糖消耗、乳酸生成及卵丘细胞中的ATP含量(P<0.05)且显著高于中腔卵泡(P<0.05),显著提高了卵母细胞中的NADPH生成及ATP含量(P<0.05)且与中腔卵泡卵母细胞组差异不显著(P>0.05)。综上,在GDF9和BMP15的协同作用下,AREG可以增强绵羊卵丘细胞的葡萄糖代谢,并且对进行IVM的小腔卵泡COCs添加AREG+GDF9+BMP15可使其葡萄糖代谢达到中腔卵泡的水平。     

精浆含量对绒山羊精液低温保存效果的影响

为了研究精浆含量对绒山羊精液低温保存效果的影响,试验以低倍稀释(1∶2)为对照组,研究以高倍稀释(1∶10,高倍稀释组)和离心洗涤(洗涤组)两种方式去除精浆后的精子保存效果,再人为添加不同浓度精浆(0、10%、20%,30%、40%)于低温保存稀释液中,测定精子活率、运动速率、顶体完整性、质膜完整性及线粒体活性等精液品质指标。结果表明:高倍稀释组在各时间段内的精子活率、运动速率[直线速率(VSL)、曲线速率(VCL)及平均路径速率(VAP)]、质膜完整率均显著高于对照组和洗涤组(P0.05);高倍稀释组的精子顶体完整率和线粒体活性与对照组和洗涤组相比无显著差异(P0.05);在外源添加不同浓度精浆的试验中,10%、20%精浆组的精子活率、质膜完整率及运动速率均显著高于其他组(P0.05),而10%、20%精浆组之间无显著差异(P0.05),但20%精浆组的各项精子质量指标略高于10%精浆组。说明在低温保存山羊精液时存在一定浓度的精浆可以有效提高保存效果,在本试验条件下10%～20%的精浆添加量比较适宜,但20%精浆组的保存效果相对更好。     

细胞因子对绵羊体外受精胚胎发育的影响

绵羊卵巢采自乌鲁木齐市屠宰场，卵母细胞体外成熟24－25h后，由体外获能的附睾精子授精，50h后，将卵裂至2－8细胞的绵羊胚胎移入添加了不同浓度细胞因子的培养液中继续培养，结果表明，加入5、10、15μg/ml胰岛素（Insulin)分别得到17.46%、23.81%、22.95%的囊胚率，与对照组9.52%相比差异显著（P＜0.05)。高浓度（500μg/ml)的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)可获得21.82%的囊胚率，与对照组7.27%相比差异显著（P＜0.05)。胚胎培养液中分别加入10、100、500ng/ml的白细胞介素－3（Interleukin-3,IL-3)、白细胞介素－8（IL－8）和神经生长因子（Nuclear growth factor,NGF)与对照组相比，囊胚率差异不显著。本研究表明，胰岛素、GM－CSF对绵羊体外受精胚胎早期发育有促进作用，IL－3、IL－8、NGF对绵羊胚胎的早期发育无明显作用。     

雄激素受体及共调节因子在睾酮调节绵羊附睾GPX5表达中的作用分析

为探究雄激素受体(Androgen receptor,AR)及共调节因子对绵羊附睾上皮细胞(Epididymal epithelial cells,EECs)谷胱甘肽过氧化物酶5(Glutathione peroxidase 5,GPX5)的调节机制,本研究采用CCK-8检测睾酮对EECs增殖的影响;利用qRT-PCR、免疫荧光法和 Western Blot法分别检测AR、GPX5、甾体激素受体共激活子 1(Steroid receptor coactivator 1,SRC-1)、CREB结合蛋白(cAMP-response element-binding protein,CBP)、p300和核受体共抑制因子2(Nuclear receptor corepressor 2,NCOR2)的mRNA水平和蛋白表达情况,采用双荧光素酶报告基因测定干扰SRC-1或p300后EECs的荧光素酶活性。结果表明:1)与对照组相比,100 nmol/L睾酮组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白表达量极显著升高(P<0.01),1 000 nmol/L睾酮组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白表达量差异不显著(P>0.05),但分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)低于100 nmol/L睾酮组;100 nmol/L睾酮组细胞中的AR mRNA和蛋白表达量分别呈极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于对照组,然而1 000 nmol/L睾酮组细胞中的AR mRNA和蛋白的表达量显著低于对照组(P<0.05);1 000 nmol/L睾酮组细胞中的CBP、p300、SRC-1蛋白表达极显著高于对照组(P<0.01),特别是核内的表达量明显增高。2)与对照组相比,siRNA-AR组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白的表达量差异不显著(P>0.05),而SRC-1和p300蛋白表达量极显著升高(P<0.01)。pcDNA3.1-AR组GPX5 mRNA和蛋白表达量较对照组呈极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)升高。3)siRNA-SRC-1 和siRNA-p300组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白表达量较对照组均显著降低(P<0.05),而AR的蛋白表达量与对照组差异不显著(P>0.05),AR的转录活性显著降低(P<0.05)。综上,睾酮对绵羊EECs GPX5、AR及其共调节因子的表达具有浓度依赖性的调节效应,睾酮通过AR及其共调节因子SRC-1和p300/CBP的协同调节GPX5表达。本研究为探究GPX5在绵羊附睾中的调节机制提供理论依据。     

雄激素和氢化可的松对山羊附睾头上皮细胞增殖的影响

为研究雄激素和氢化可的松对山羊附睾上皮细胞生长的作用模式,本研究利用酶标仪检测附睾头部上皮细胞增殖情况,实时荧光定量PCR及ELISA检测雄激素受体(AR)的表达,检测睾酮与氢化可的松对山羊附睾上皮细胞体外增殖的作用以及对AR表达的影响。结果表明:100nmol/L睾酮对附睾头上皮细胞增殖的促进效应最高且与对照组差异极显著(P0.01),200nmol/L氢化可的松促进附睾头上皮细胞增殖效应最佳并与对照组差异显著(P0.05),前者的效应明显且可以被AR阻断剂阻断;睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞增殖表现为协同作用;100nmol/L睾酮与200nmol/L氢化可的松均使附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量上调,与对照组差异显著(P0.05),且二者共存时附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量极显著高于对照组(P0.01)。本研究表明睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞体外增殖均有促进作用,呈明显的浓度依赖性,且二者之间存在协同作用,这为进一步研究附睾上皮细胞增殖及功能的调节机理提供了基础。     

蒙古羊羊水源干细胞分离培养及其成骨分化研究

试验旨在建立羊水源干细胞系并对其诱导形成成骨细胞的潜能进行研究。在胎牛血清浓度为15%的条件下对羊水源干细胞进行建系,并检测其类胚体形成能力;检测不同代数细胞的干细胞标志基因Oct-4、SH2、SSEA-1、Nanog、HLA-ABC、CD117的表达情况;利用地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸等因子进行诱导。结果表明,羊水源干细胞在体外可以持续增殖,悬浮培养形成的类胚体表达三胚层相关标记基因,经诱导可形成成骨细胞。试验成功分离了蒙古羊的羊水源干细胞并建系,且其具有向成骨细胞分化的潜能。     

内蒙古白绒山羊附睾精子冷冻效果的研究

本试验把不同温度下的样品分成3个处理组,通过检测精子与繁殖力有关的重要指标研究3个处理组的冷冻效果,结果显示, 在3个不同的环境下收集附睾,室温下(19 ℃)收集附睾精子(处理1组)的冷冻效果最好,解冻后活率为(55.0±3.4)%;4 ℃下收集的精子(处理2组)冷冻解冻后的活率为(35.0±2.5)%;37 ℃下收集的精子(处理3组)的冷冻效果较差,解冻后活率为(23.0±2.5)%。通过对处理组中冷冻和解冻后两个阶段的精子指标的测定,研究了精子活率与其他指标的关系,得出白绒山羊附睾精子能够成功的保存。     

浅海养殖围网敷设海域水文条件研究

根据海洋调查规范,对围网敷设海域温州平阳南麂岛海域的水文条件、海域情况进行了调查和监测,并以水文条件为参考,分析了大潮差条件下的防网衣纠缠技术、水流和波浪条件下的防逃贴底技术与抗风浪技术,以期为给浅海围网养殖技术的完善和推广提供理论依据.监测结果:调查海域的水温变化范围为10.3～29.5℃;盐度垂向分布总体较均匀,变化范围为27.63 ～33.91;营养盐比较丰富,水色以绿至浅蓝为主,透明度一般大于2 m;水流速度小于1 m·s-1,最大潮差6.13 m,波浪以0～3级为主.结果表明,温州平阳南麂岛海域适合开展大黄鱼浅海围网养殖.     

AREG对绵羊小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响

旨在研究双调蛋白（AREG）对绵羊小腔卵泡卵母细胞体外成熟（IVM）的影响。本研究从屠宰场绵羊卵巢上采集小腔和中腔卵泡的卵母细胞进行试验，利用自发荧光检测卵母细胞的NAD （P） H和FAD⁺⁺水平，利用JC-1检测卵母细胞的线粒体膜电位；两种来源的卵母细胞经体外成熟后，比较其卵丘扩展指数（CEI）、第一极体排出率（MII%）；比较AREG、AREG+GDF9、AREG+BMP15、AREG+GDF9+BMP15、GDF9+BMP15对小腔卵泡卵母细胞体外成熟后的CEI、MII%及卵母细胞线粒体膜电位的影响；检测了AREG+GDF9+BMP15对小腔卵泡卵母细胞体外成熟后的NAD （P） H和FAD⁺⁺水平及其受精后发育能力的影响。结果表明，成熟前，小腔卵泡卵母细胞的线粒体膜电位和FAD⁺⁺水平均显著低于中腔卵泡卵母细胞（P<0.05）；体外成熟培养后，小腔卵泡卵母细胞的CEI和MII%均显著低于中腔卵泡卵母细胞（P<0.05）。与对照组相比，AREG+GDF9+BMP15显著提高了小腔卵泡卵母细胞体外成熟后的CEI、MII%和线粒体膜电位（P<0.05），且与中腔卵泡卵母细胞组差异不显著（P>0.05）；另外，AREG+GDF9+BMP15显著提高了小腔卵泡卵母细胞体外成熟后的NAD （P） H和FAD⁺⁺水平（P<0.05），且与中腔卵泡卵母细胞组差异不显著（P>0.05）。与对照组相比，在成熟液中添加AREG+GDF9+BMP15可以明显提高小腔卵泡卵母细胞体外受精后的卵裂率和囊胚率（分别为（43.79±3.69）%、（28.54±4.31）%和（78.99±1.12）%、（47.46±2.50）%，P<0.05），而且与中腔卵泡卵母细胞组无显著差异（P>0.05）。综上表明，绵羊小腔卵泡卵母细胞的代谢水平及IVM质量较低， AREG在GDF9和BMP15的协同作用下可以显著提高小腔卵泡卵母细胞的代谢水平及IVM质量，并进一步提高小腔卵泡卵母细胞体外受精后的发育能力。