基于全基因序列的中国北方3省(区)马铃薯Y病毒遗传多样性分析

本研究以马铃薯Y病毒(PVY)全基因组为基础,分析吉林、黑龙江和内蒙古3省(区)PVY群体遗传多样性和群体分化,并评估突变、重组、选择等遗传力所起的作用。根据已报道的PVY全基因序列保守区设计4对引物,采用片段重叠法对来自内蒙古和吉林的24个PVY分离物全基因序列进行测定,并联合NCBI中已登录的9个黑龙江分离物全基因组序列进行遗传多样性参数评估、群体分化检验和分子变异等分析。结果显示,我国北方3省(区)PVY群体遗传多样性高,其中内蒙古和黑龙江PVY群体遗传多样性高于吉林群体,并且3个群体之间呈现一定程度的遗传分化。分子变异分析发现在PVY基因组中存在1 786个变异位点,表明我国北方3省(区)PVY群体变异程度较高,并且这种高变异度有85.54%来自各个马铃薯种植区内PVY个体的遗传变异。重组分析和系统发育分析发现,我国北方3省(区)PVY群体中重组株系占比高达90.3%,并具有明显的株系多样性,表明PVY重组株系已成为我国北方3省(区)马铃薯种植区的流行株系。选择压力分析显示,使用FEL和IFEL法分别检测出501个和315个净化压力选择位点,这表明3省(区)PVY群体受净化选择压力为主。以上结果表明,中国北方3省(区)PVY群体遗传多样性高,突变、重组和自然选择都对遗传多样性和群体分化存在一定影响。     

胜红蓟上一种与双生病毒伴随的重组β卫星分子的鉴定

双生病毒是一类在全球范围内危害严重的单链环状DNA病毒。本研究从2017年采自云南的胜红蓟样品中(YN2017)获得了一条菜豆金色花叶病毒属病毒和一条β卫星的全基因组序列。该双生病毒的全长序列与烟草曲茎病毒的相似性最高,为99.60%,确定为烟草曲茎病毒的分离物。YN2017β卫星与中国胜红蓟黄脉β卫星的同源性最高,为90.8%。进一步分析发现,该β卫星的卫星保守区域(SCR)至富含腺嘌呤区(A-rich区)之间约1 kb的序列与中国胜红蓟黄脉β卫星相应序列的相似性高达97.2%;其包含的A-rich区上游与SCR之间约300 bp的序列与中国胜红蓟黄脉β卫星相应序列的相似性仅为70.2%,而与烟草曲茎β卫星相应序列的相似性最高,为97.3%。重组分析发现,所分离的β卫星是由中国胜红蓟黄脉β卫星和烟草曲茎β卫星重组产生。这是首次在中国发现由不同的β卫星重组产生的β卫星分子。     

基于单克隆抗体的南方菜豆花叶病毒血清学检测技术

为建立南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,SBMV)的快速、简便、高通量检测技术,加强该病毒的口岸检验检疫,以提纯的SBMV粒子为免疫原免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤技术获得3株杂交瘤细胞株19C3、19H9和20G4,其分泌的SBMV腹水单抗效价均达到10-7,且3个单抗与感染SBMV大豆叶片组织粗提液有强烈的特异性免疫反应,而不与感染南方豇豆花叶病毒(southern cowpea mosaic virus,SCPMV)的豇豆、健康的大豆、毛豆、豌豆、蚕豆和菜豆叶片组织粗提液发生免疫反应。以制备的单抗为核心,建立了检测植物中SBMV的ACP-ELISA和dotELISA两种血清学方法。3个单抗中19H9单抗的检测灵敏度最高,以其建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测大豆病叶粗提液的灵敏度分别达到1∶163 840和1∶10 240稀释浓度。利用建立的dot-ELISA方法可从上海口岸截获的大豆种子中检测出SBMV,且该检测结果得到RT-PCR方法验证。表明制备的SBMV单抗及建立的SBMV血清学检测技术可有效用于我国SBMV的口岸检验检疫。     

烟草曲叶病病原的鉴定及其细胞病理

应用电镜技术，结合粉虱传双生病毒的多抗血清和单克隆抗体采用免疫电镜（ISEM）和三抗体夹心酶联免疫吸附测定（TAS－ELISA），对云南烤烟、香料烟和白肋烟3种类型烟草上的曲叶病病原进行了检测鉴定，其病原为粉虱传双生病毒（WTG）；根据单克隆抗体分析表位抗原，可分为3组，其中香料烟曲叶病分离物中三者皆有，烤烟和白肋烟曲叶病分离物与香料烟曲叶病的一个分离物同属一组表位抗原类型；对3种烟草曲叶病的病原细胞进行了观察，在核内观察到典型的纤维环，细胞核和细胞质内都含大量的双生病毒颗粒，在细胞质中有病毒颗粒的聚集块，在胞间连丝中观察到病毒颗粒。     

TMV蚕豆株系CP基因及3′端非编码区序列分析与表达

根据烟草花叶病毒Ｕ１株系ＴＭＶ－Ｕ１序列，人工合成引物，通过ＰＣＲ扩增并克隆了烟草花叶病毒蚕豆株系（ＴＭＶ－Ｂ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和３′端非编码区．ＤＮＡ全序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长４５９个碱基，编码１５１个氨基酸，３′端非编码区全长２２４个碱基．与ＴＭＶ－Ｕ１株系相比，ＴＭＶ－Ｂ仅在ＣＰ基因上有一个碱基缺失，并导致ＣＰ基因提前终止，使其编码的氨基酸少７个．将ＣＰ基因及３′端非编码区插入ｐＧＥＭＥＸ－１的Ｔ７基因１０中，转入Ｅ．ｃｏｌｉ后诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异的蛋白带．Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫检测证明，该特异带与ＴＭＶ抗血清呈阳性反应．将ＣＰ基因正向插入植物表达载体ＰＢⅠ１２１中，置于花椰菜花叶病毒３５Ｓ启动子控制之下，获得了植物表达载体ｐＺＬ５     

侵染绿花椰菜的黄瓜花叶病毒（CMV）研究

从杭州市郊菜园表现严重花叶、矮化症状的绿花椰菜病株上获得一病毒分离物Ｃ－９３１。汁液摩擦接种６科２１种植物，Ｃ－９３１可侵染其中的６科１９种；体外抗性测定表明Ｃ－９３１的稀释限点（ＤＥＰ）为１０￣（－２），致死温度（ＴＩＰ）为５５－６０℃，２５℃体外存活期（ＬＩＶ）为４ｄ；提纯病毒粒体球形，平均直径２８ｎｍ；在琼脂双扩散反应中Ｃ－９３１能与ＣＭＶ抗血清呈阳性反应；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得其衣壳蛋白亚基分子量为２９ｋＤ；用ＣＦ－１１纤维素柱提取受侵植物组织中ｄｓＲＮＡ，电泳鉴定表明共有５个核酸组分，长度（ｋｂ）分别为３．３，３．０，２．２，０．９和０．３５．根据上述性状，Ｃ９３１被鉴定为黄瓜花叶病毒，且该分离物含卫星ＲＮＡ。     

TMV蚕豆株系CP基因及3‘端非编码区序列分析与表达

根据烟草花叶病毒Ｕ１株系ＴＭＶ－Ｕ１序列，人工合成引物，通过ＰＣＲ扩增并克隆了烟草花叶病毒蚕豆株系（ＴＭＶ－Ｂ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和３＇端非编码区。ＤＮＡ全序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长４５９个碱基，编码１５１个氨基酸，３＇端非编码区全长２２４个碱基。与ＴＭＶ－Ｕ１株系相比，ＴＭＶ－Ｂ仅在ＣＰ基因上有一个碱基缺失，并导致ＣＰ基因提前终止，使其编码的氨基酸少７个。将ＣＰ基因及３＇端非编码区插     

烟草不同时期接种烟草花叶病毒后的种子带毒率比较

烟草种子带毒一直对烟草生产危害较大.烟草品种K326、云烟85和云烟87在不同时期分别接种烟草花叶病毒(TMV)后收集烟株种子,采用三抗体夹心法(TAS-EKLISA)检测TMV带毒情况,结果表明,接种TMV后病株上采收的种子的平均带毒率超过50%,但不同时期接种和不同品种间烟草种子带毒率存在明显差异.     

烟草曲茎病毒复制相关蛋白基因原核表达条件优化

    为了提高烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus, TbCSV)复制相关蛋白(replication-associated protein, Rep)基因在大肠杆菌中表达量,研究了大肠杆菌菌株、温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对GST-Rep融合蛋白表达量的影响.结果表明,大肠杆菌菌株Rosetta在37℃培养3 h后,使用终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG在28℃诱导培养4 h时,GST-Rep融合蛋白表达量最高,表达的GST-Rep融合蛋白可占细菌总蛋白的42%以上.用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-Rep融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小约为66 kD,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与GST多克隆抗体起特异性反应.Rep基因的优化表达为研究该基因的作用机理打下了基础.