猪口蹄疫O型灭活疫苗PD50效检攻毒方式探索

用10 000 TCID50的OR/80株F13细胞毒或用10 000 LD50的OR/80株乳鼠组织毒(ORMF8),通过肌肉注射途径、蹄踵球部或趾间皮内注射途径接种O型口蹄疫抗体阴性架子猪进行攻毒试验,三种途径均不能使试验猪产生规律性发病.     

猪CD3∈分子的cDNA克隆与序列分析

应用RT-PCR和3′RACE技术,本研究从猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪CD3ε基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,猪CD3εcDNA序列长1241nt,其中5′非翻译区80nt,3′非翻译区570nt,开放阅读框591nt,该开放阅读框编码196个氨基酸残基的CD3ε前体蛋白(无糖基化位点);在猪CD3ε蛋白的胞外区,Cys49、Cys91、Cys108和Cys111为保守性氨基酸残基,它们与CD3ε免疫球蛋白样结构的形成有关。在猪CD3ε蛋白胞浆区,存在免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)、内质网潴留基序和1个SH3结合基序,其中ITAM基序含有2个SH2结合基序和2个潜在酪氨酸磷酸化位点Tyr177和Tyr188,这些基序是猪CD3分子参与T细胞活化信号转导和TCR-CD3复合体装配的结构基础。推导氨基酸序列分析结果表明,猪与人、鼠、狗、牛和绵羊CD3ε蛋白的氨基酸同源性分别为61.2%、58.7%、58.7%、65.1%和65.6%。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建及其免疫效果

构建了泛素（ubiquitin，Ub）基因与密码子优化的PRRSVGP5蛋白（optiGP5）基因融合表达质粒pIR—Ub—optiGP5。间接免疫荧光和Western—blot分析表明，重组质粒转染293T细胞后能够瞬时表达。将pIR—optiGP5和pIR—Ub—optiGP5两种质粒DNA肌肉注射免疫BALB／c小鼠后，分别检测小鼠血清中抗GP5抗体、T淋巴细胞的增殖能力以及CTL活性。结果显示，pIR—optiGP5质粒免疫组在二免后可以检测到荧光抗体，而pIR—Ub—optiGP5质粒免疫组一直未检测到抗GP5抗体，但该免疫组的T淋巴细胞增殖指数及针对GP5的特异性CTL反应数值明显高于pIR—optiGP5质粒免疫组。这表明泛素与GP5的融合表达可增强细胞免疫反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a( ),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

规模化猪场脑心肌炎病毒感染的血清学调查

脑心肌炎病毒(EMCV)可引起猪的脑炎、心肌炎和母猪繁殖障碍,该病已在世界上多个国家暴发和流行。我国对EMCV及其所致疾病的研究工作还处于起步阶段,为了揭示EMCV在我国规模化猪场的感染情况,我们应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对2005-2006年间采集自全国13个省市46个规模化猪场的3250份血清样本进行了EMCV抗体检测,结果显示,各省阳性率在39.64%~90%之间,平均抗体阳性率为72%,监测的46个猪场都存在EMCV感染,猪场感染阳性率为100%;对不同生长阶段猪群检测结果表明,EMCV抗体阳性率随猪龄的增长而升高,且不同生长阶段猪抗体阳性率差异极显著;成年公猪的抗体阳性率高于成年母猪。本项调查表明,我国规模化猪场已经普遍感染EMCV,这应引起我国养猪业警惕,并做好该病的综合防控。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的构建

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR/PCR扩增,分别扩增出大小为308 bp和417 bp的部分基因片段。用T4连接酶将目的片段与pGEM-Teasy载体系统连接,并转化到大肠杆菌DH-5α株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV和PCV2的阳性重组质粒。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),建立了PRRSV、PCV2的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。     

猪脑心肌炎病毒的分离与鉴定

从规模化猪场疑似病例组织病料中分离到5株脑心肌炎病毒（EMCV），对其中的2株（EMCV BJC3和EMCV HB1）进行了系统鉴定。结果表明，病毒粒子大小约为27nm，呈圆形；2株病毒均不耐酸，对氯仿不敏感，对胰蛋白酶敏感性有所不同，60℃加热1h可被灭活，二价阳离子对病毒没有明显的保护作用。用EMCV多克隆抗体作间接免疫荧光，分离毒株感染的BHK-21细胞的胞浆中可见特异性荧光。对分离毒株进行了VP1和3D基因的扩增和序列测定，结果表明，2个毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为99．49％，氨基酸序列的同源性为98．46％，与GenBank中EMCV毒株的核苷酸序列同源性介于81．61％～99．59％，氨基酸序列同源性在95．5％以上；3D基因扩增片段序列与其它毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100％。基于VP1基因的系统进化树表明，2株分离毒均位于进化树的主干上，变异度不大。由此表明，EMCV感染已在我国猪场存在。     

B型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及生物活性鉴定

血凝素是副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum，Hpg）的主要抗原成分之一，鸡只对Hpg的免疫力与血凝素抗体滴度成正相关。根据GenBank上已发表的B型Hpg Dalian株的血凝素基因序列（AY622378），设计合成了1对特异扩增Hpg血凝素基因的引物。以大连分离株Hpg中提取的细菌DNA为模板，利用PCR扩增出了1038bp的血凝素基因，将其克隆到pET-32a载体上，构建了pET-HA原核表达质粒并在BL21。大肠杆菌中过量表达。血凝试验显示纯化的重组蛋白具有血凝活性；Western试验证明该重组蛋白可以被B型Hpg特异性鸡血清所识别。本研究在国内首次对Hpg的血凝素基因进行克隆表达，并分析了重组蛋白的血凝活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪肺泡巨噬细胞外源性抗原加工递呈相关分子和共刺激分子的影响

采用定量竞争PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染后不同时相猪肺泡巨噬细胞（PAM）中外源性抗原加工递呈相关分子SLA-DR、Ii链和SLA-DM分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的mRNA转录动态进行了定量检测。结果表明,PRRSV感染后PAM的SLA-DR mRNA转录水平在3、7和14 d下调,低于对照组;感染后3 d,Ii链、SLA-DM和CD40的mRNA转录水平极显著下调（P〈0.01）;CD80和CD86mRNA转录水平也在感染后3 d明显下调（P〈0.05）。用流式细胞术检测PAM表面的SLA-DR抗原的结果表明,在感染后3 d短暂上升,7 d之后一直低于对照组。由此说明,PRRSV感染早期对猪肺泡巨噬细胞的外源性抗原加工和递呈功能产生显著影响,导致其外源性抗原递呈功能下降,进而影响机体的体液免疫应答。     

猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(CH-1R株)工厂化生产培养条件的研究

为提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活疫苗CH-1R株的产量和疫苗的质量,本实验探索了PRRSV活疫苗CH-1R株在MARC-145细胞中大规模生产培养的最佳条件。将CH-1R株分别在3L和10L转瓶培养的MARC-145细胞中进行增殖试验,分析CH-1R株在不同接种病毒量和不同接种病毒时间的TCID50变化规律。结果表明,在3L和10L转瓶中,病毒的TCID50最高可达到107.0TCID50/mL以上。CH-1R株通过转瓶在MARC-145细胞中大规模增殖,为PRRSVCH-1R株的工厂化生产奠定了基础。