禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定

为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植。利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T_0阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T_1叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T_3植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性。结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-HA成功导入到根癌农杆菌EHA105中;PCR检测到有66株植株的HA基因成功整合到水稻基因组;Dot Blot和Western Blot检测结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达;利用荧光定量PCR方法,107株T_1中筛选到31株纯合植株;Western Blot检测结果表明,杂交后的HA蛋白表达量大幅度提高;双抗夹心ELISA结果证实,水稻胚乳表达的HA蛋白的活性高于杆状病毒-昆虫细胞。     

水貂细小病毒NS1与VP2蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了比较VP2和NS1两种蛋白的免疫原性,选择免疫原性较好的蛋白进行亚单位疫苗制备。本试验分别扩增了水貂细小病毒(mink enteritis virus,MEV)NS1与VP2基因,连接pET-32a表达载体并进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。以His-Bind亲和层析柱纯化目的蛋白,将纯化后的蛋白免疫小鼠,分析目的蛋白的免疫原性。经SDS-PAGE与Western blotting鉴定,表明NS1与VP2蛋白大小分别为83 和67 ku,且均具有生物学活性;免疫小鼠后,目的蛋白NS1和VP2均可诱导小鼠产生抗MEV特异性抗体,且VP2蛋白诱导小鼠产生的抗体滴度要高于NS1蛋白。与NS1蛋白比较,VP2蛋白更适合亚单位疫苗的制备。     

水貂白细胞介素-4基因的克隆、序列分析与原核表达

为了获得高纯度的白细胞介素-4（IL-4）蛋白,对分离得到的水貂外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导后,提取淋巴细胞总RNA,根据GenBank中登录的雪貂IL-4基因序列,设计并合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得了水貂IL-4基因序列全长399 bp,编码132个氨基酸,与雪貂氨基酸序列同源性高达99.2%,与熊猫、犬同源性均为90.0%。将编码成熟蛋白基因构建到原核表达载体pProEX-HTb,IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting结果显示,IL-4表达产物为15 ku的包涵体蛋白。通过His-Trap HP亲和层析预装柱变性、复性洗脱可获得高纯度的重组IL-4蛋白。本试验为水貂IL-4基因的进一步研究奠定了基础。     

水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒F蛋白信号肽区基因克隆及遗传变异分析

为了解近年来犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)在中国毛皮动物主要养殖区的流行情况及遗传变异情况,本试验于2012-2014年从山东、河北、辽宁收集疑似犬瘟热的水貂、狐狸和貉病料,经犬瘟热抗原检测试纸条检测和RT-PCR检测为阳性后,克隆测序了15株CDV F蛋白信号区(Fsp)基因序列.序列分析结果显示,15株CDV野毒株Fsp基因核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均为93.6%~100.0%,与疫苗株相似性为80.7%~81.7%.基因系统进化分析结果显示,15株野毒株均属于中国当前流行的Asia-1基因型.氨基酸序列比对分析结果显示,Fsp蛋白在氨基酸3-14、16-37、47-67位等处存在高变异.通过对当前流行CDV野毒株Fsp基因序列分析,结果表明该Fsp基因区具有较高的变异率,可作为CDV基因分型的依据,同时本试验结果为毛皮动物犬瘟热的防控提供了参考依据.     

水貂阿留申病诊断技术的研究进展

水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒引起的自身免疫性疾病,目前尚无有效疫苗,每年结合打皮期筛查淘汰病貂是该病防控的主要手段.目前,水貂阿留申病的主要诊断方法是依据临床症状和血清的对流免疫电泳检测.对流免疫电泳需要在实验室内进行,使用范围局限.综述了国外该病诊断的最新研究进展,以期为该病诊断技术的开发提供思路.     

单克隆抗体制备的关键因素

单克隆抗体在实验室和临床上有广泛的应用,它是基础免疫研究、诊断测试和疫苗质量控制方面必要的研究工具。本文主要阐述了单克隆抗体生产中的关键步骤,特别是抗原的准备、细胞和动物的考虑(选择)、佐剂及复合物的制备、注射方式、细胞融合和腹水收集方法,以期在单抗制备过程中减少动物的痛苦,获得最佳的免疫反应。     

B细胞抗原表位预测方法的研究进展

抗原表位是抗原分子的主要功能单位。B细胞抗原表位的准确定位对疫苗设计、诊断试剂的研发及高通量抗体的制备均具有重要意义。作者对目前常用的B细胞线性表位预测方法和B细胞构象表位预测方法进行概述,并对不同预测方法进行比较,旨在为病原微生物抗原表位研究提供一定的理论参考。